Resumo

ARTIGO

Estudo da influência dos íons K⁺, Mg²⁺, SO₄^2- e CO₃^2- na cristalização biomimética de fosfato de cálcio amorfo (ACP) e conversão a fosfato octacálcico (OCP)

Study of the influence of K⁺, Mg²⁺, SO₄^2- and CO₃^2- ions in the biomimetic crystallization of amorphous calcium phosphate (ACP) and conversion into octacalcium phosphate (OCP)

Anahí Herrera Aparecida^* * e-mail: aherrera@posgrad.iq.unesp.br ; Marcus Vinícius Lia Fook; Márcio Luis dos Santos; Antonio Carlos Guastaldi

Departamento de Físico-Química, Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, R. Francisco Degni, s/n, 14800-900 Araraquara – SP, Brasil

ABSTRACT

The crystallization of hydroxyapatite (HA) in aqueous solution can be described by the mechanism ACP ® OCP ® HA. In this work, it was studied the influence of K⁺, Mg²⁺, SO₄^2- and CO₃^2- ions in the formation of ACP and in its conversion to OCP, using biomimetic coatings on metallic substrates of commercially pure titanium (Ti c.p.). The results showed that Mg²⁺ and CO₃^2- ions favored both the formation of ACP and its conversion to OCP. Differently, K⁺ and SO₄^2- ions did not influence the formation of ACP and, consequently, interfered in the conversion to OCP.

Keywords: biomimetic coating; amorphous calcium phosphate; octacalcium phosphate.

INTRODUÇÃO

Durantes as décadas passadas, as biocerâmicas de fosfato de cálcio têm sido amplamente utilizadas em aplicações médicas, ortopédicas e odontológicas, como recobrimentos ou materiais densos para a reposição e reparação do tecido ósseo, devido à similaridade química e estrutural com a apatita biológica, que propicia a interação direta com o tecido ósseo^1-4. Uma forma conveniente de classificar os fosfatos de cálcio é através da razão molar entre os átomos de cálcio e fósforo - Ca/P, a qual varia de 0,5 a 2,0 conforme mostra a Tabela 1. Os fosfatos de cálcio podem ser sintetizados por precipitação a partir de soluções contendo íons Ca²⁺ e PO₄^3-, sob condições alcalinas ou ácidas.

A hidroxiapatita – HA, por constituir o principal componente mineral dos ossos, é o fosfato de cálcio mais utilizado como biocerâmica, seja como recobrimento ou material denso¹. Contudo, além da HA, vários outros fosfatos de cálcio também ocorrem em calcificações normais e patológicas, o que vem despertando interesse significativo nas possibilidades de utilização destes materiais como biocerâmicas⁵. A Tabela 2 relaciona diversos fosfatos de cálcio e suas ocorrências em sistemas biológicos.

A utilização de HA em recobrimentos tornou-se popular em implantes dentários e ortopédicos devido às seguintes vantagens: rápida adaptação óssea, não formação de tecido fibroso, íntima adesão implante/tecido, tempo de cicatrização reduzido e maior tolerância a imprecisões cirúrgicas. A estas vantagens podem estar associadas outras características, como um sistema de manutenção do osso ao redor da área recoberta que aumenta a tolerância às mudanças ósseas naturais inevitáveis⁶. Apesar de todas estas vantagens, o uso clínico da HA é limitado devido à sua lenta biodegradação. Estudos efetuados por longos períodos de tempo têm mostrado que a HA começa a ser reabsorvida gradualmente após 4 a 5 anos de implantação. A reabsorção é uma característica desejada para biomateriais nos quais o processo de degradação é concomitante com a reposição do osso em formação⁵.

Fosfato de Cálcio Amorfo – ACP

Quando fosfatos de cálcio são precipitados a partir de soluções aquosas supersaturadas, com pH neutro ou alcalino, uma fase amorfa metaestável forma-se rapidamente nos estágios iniciais da reação^7,8. Esta fase é denominada fosfato de cálcio amorfo – ACP, cuja fórmula é Ca₃(PO₄)₂.nH₂ O, com n = 3 a 4,5, e que corresponde à hidroxiapatita deficiente em cálcio - HA_D com composição Ca₉H₂(PO₄)₆ .n'H₂O.

Alguns autores descrevem que ACP se converte diretamente a HA, contudo, a formação de fosfato octacálcico – OCP – como fase intermediária pode ocorrer e é descrita por outros autores^8,9.

Embora não pareça existir em quantidade detectável nos tecidos duros dos vertebrados, o ACP tem sido encontrado em muitos sistemas biológicos e como parte da composição de recobrimentos obtidos por aspersão térmica ("plasma-spray"). Esta fase de apatita tem sido relatada como responsável pela otimização das propriedades mecânicas destes recobrimentos, especialmente a adesão a superfícies metálicas, e das propriedades biológicas. O aumento da quantidade de ACP em recobrimentos melhora a osteocondutividade, contudo pode ocasionar a degradação do material, danificando sua integração biológica com o tecido vivo¹⁰.

Fosfato Octacálcico – OCP

O fosfato octacálcico (OCP) - Ca₈H₂(PO₄)₆ .5H₂O - apresenta importância biológica tanto quanto o ACP e a HA, pois é um importante precursor na formação de ossos e dentes. O OCP tem estrutura similar à HA e, freqüentemente, aparece como um intermediário em sua formação. Em solução aquosa, esta fase pode ser considerada como uma fase de transição, pois é formada como intermediária na conversão do ACP a HA, segundo o mecanismo ACP®OCP®HA, que pode ser influenciado por diferentes fatores, tais como temperatura, pH e composição da solução^9,11,12.

Entre as técnicas de recobrimento o método biomimético vem se destacando entre os demais, pois possibilita a mimetização do processo biológico de formação de tecidos rígidos. Inicialmente proposto por Kokubo et al.¹³, este método utiliza uma solução aquosa denominada "Simulated Body Fluid - SBF" de composição e pH similares ao fluido corpóreo. Dentre as diversas vantagens apresentadas por este método, pode-se destacar a possibilidade de controle de espessura da camada, tamanho de grãos e diversidade de forma cristalina.

Tanto no meio biológico quanto em solução aquosa como a SBF, a formação de apatitas ocorre em meio contendo, além de íons Ca²⁺ e PO₄^3-, íons-traços essenciais tais como: Mg²⁺, HCO₃^-, K⁺ e Na⁺. Alguns destes íons apresentam propriedades específicas frente à formação de HA e de outras fases de apatita^9,14,15. O objetivo deste trabalho foi estudar a influência dos íons K⁺, Mg²⁺, SO₄^2- e CO₃^2- na formação da fase precursora ACP e na sua conversão a OCP. Utilizaram-se neste trabalho soluções biomiméticas com composições variadas e substratos metálicos de titânio comercialmente puro - Ti c.p.

PARTE EXPERIMENTAL

Amostras de Ti c.p., depois de cortadas nas dimensões de 0,5 X 1,0 X 0,3 cm, foram lixadas com lixas d'água de granulometria 180 mesh, limpas em ultra-som por 15 min em mistura de acetona e álcool etílico e 15 min em água desmineralizada. Logo após, foram colocadas em solução de NaOH 5M por 24 h em estufa a 60 ºC e, então, secas por 3 h, também em estufa a 60 ºC. Para analisar o efeito da composição da solução SBF na obtenção das fases ACP e OCP, seis diferentes soluções foram preparadas, com reagentes de grau analítico e água desmineralizada, como mostra a Tabela 3.

Na Tabela 3, a solução denominada SBF 0 é a solução padrão utilizada pelo método biomimético, com a presença de todos os íons em sua composição. Com a utilização da solução modificada SBF 1, avaliou-se o efeito da ausência dos íons-traços essenciais na formação das fases de apatita em estudo. Nas soluções denominadas SBF 2, 3 e 4, os íons em estudo foram Mg²⁺, K⁺ e SO₄^2-, respectivamente, todos na concentração de 1mM. O comportamento do íon CO₃^2- foi avaliado em duas concentrações, 3 e 5 mM, utilizando-se as soluções SBF 5 e 6, respectivamente.

As amostras foram mantidas em cada SBF a 37 ºC por 7 dias, efetuando-se a troca da solução a cada 48 h.

Os recobrimentos obtidos foram analisados utilizando-se as técnicas de microscopia eletrônica de varredura (MEV), usando microscópio JEOL-JSM, modelo T-330 A acoplado a espectrômetro de energia dispersiva de raios X - EDX e à câmera fotográfica; difratometria de raios X – DRX, utilizando um difratômetro de raios X Siemens D5000 com varredura angular entre 10 e 70º com passo de 0,02 (2q), sendo que o tempo de passo foi de 1,0 s para cada amostra; espectroscopia no infravermelho médio – IV (com número de ondas de 4000 a 400 cm^-1), realizada com espectrômetro Perkin Elmer, FT-IR Spectrometer-Spectrum 2000 de reflectância difusa Drift Collector.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Recobrimento por SBF 0

Por imersão em SBF 0, obteve-se sobre a superfície do Ti c.p. um recobrimento compacto e de grãos esféricos com trincas de aproximadamente 10 µm. Por EDX, notou-se que o recobrimento é composto somente pelos elementos Ca e P, em uma razão Ca/P de 1,45. A caracterização por DRX mostrou que este recobrimento é composto por uma mistura de fases correspondentes ao fosfato octacálcico (OCP) e à hidroxiapatita deficiente em cálcio (HA_D) – Ca_9,04(PO₄)₆(OH) _1,68, Figura 1. O espectro de IV mostrou bandas características de grupos PO₄ em 387, 646, 984 e 1144 cm^-1, P-OH em 515 cm^-1 e apatita carbonatada do tipo B em 1464 e 876 cm^-1, que pode ser atribuída também ao grupo P-OH.

A formação de ACP a partir de uma solução aquosa envolve um período de indução (t_ACP), o qual pode ser alterado mediante as condições de temperatura, pH e composição da solução. A presença de íons Mg²⁺, CO₃^2-, F^-, P₂O₇^4- e poliacrilatos reduz significantemente este período. Diferentemente, a presença de íons como Na⁺ e K⁺ não altera este período de indução⁹.

Após sua cristalização, o ACP sofre hidrólise originando OCP ou HA, segundo o mecanismo⁹:

ACP ® OCP ® HA_D (Ca/P < 1,67) ® HA (Ca/P = 1,67) ou ACP ® HA

O estudo do comportamento hidrolítico do ACP mostra que o mecanismo da conversão é governado por um processo de dissolução-reprecipitação, devido à alta solubilidade da fase amorfa comparada à fase cristalina. Em pH fisiológico (7,4), a hidrólise do ACP é descrita por um processo em duas etapas. Na primeira, ocorre a diminuição da razão Ca/P da fase sólida (inferior a 1,5) associada ao aumento do pH e ao aumento da razão Ca/P da solução (maior que 1,5). Na segunda etapa, um aumento na razão Ca/P do sólido é observado devido ao consumo de íon OH^- da solução e uma diminuição da razão Ca/P da solução. Esta etapa é caracterizada como hidrólise do OCP a hidroxiapatita¹⁰.

A partir dos dados obtidos, pode-se notar que a composição da solução SBF 0 possibilitou a cristalização completa do ACP, devido à redução do t_ACP ocasionada pela presença dos íons Mg²⁺ e CO₃^2- e sua total conversão a OCP. Esta última fase converteu-se parcialmente a HA deficiente em cálcio, conforme o mecanismo mostrado.

Recobrimento por SBF 1

O recobrimento obtido por imersão em SBF 1 apresentou morfologia característica de fase amorfa de fosfato de cálcio, composta por grãos esféricos⁹. A presença dos elementos Ca e P deu-se em uma razão de 1,4. Por DRX, Figura 2, observou-se que somente a fase ACP estava presente no recobrimento. O espectro de IV, Figura 2cS, confirmou os resultados obtidos por DRX, pois apresentou bandas características dos grupos PO₄ (em 662 e 1301 cm^-1) e P-OH (em 1045 cm^-1) e da fase amorfa de fosfato de cálcio (em 573 cm^-1). Além destas bandas, o recobrimento apresentou bandas referentes ao grupo CO₃^2- da apatita carbonatada tanto do tipo A (em 1557 cm^-1) quanto do tipo B (em 1409 e 1468 cm^-1), caracterizando uma apatita carbonatada do tipo AB. Mesmo a solução SBF 1 não contendo o íon CO₃^2- em sua composição, a presença de apatita carbonatada no recobrimento é possível pela reação entre os íons OH^- da apatita com CO₂ do ar, durante o período de imersão, segundo a reação⁹:

2OH^-_(apatita) + CO_2(ar)® CO₃^2-_(apatita) + H₂O

O fato da solução SBF 1 conter, além dos íons Ca²⁺ e PO₄^3-, somente os íons Na⁺ e Cl^- contribuiu para a obtenção majoritária de ACP no recobrimento, pois estes íons não alteram t_ACP, não favorecendo sua conversão a OCP.

Recobrimento por SBF 2

Por imersão em SBF 2, obteve-se um recobrimento com morfologia característica das fases amorfa de fosfato de cálcio e OCP, este último caracterizado por cristais orientados perpendicularmente semelhante a agulhas (acuniformes)^11,12,15. Por DRX, observou-se somente a presença destas fases, Figura 3. A razão Ca/P foi de 1,35. O espectro de IV apresentou bandas características dos grupos P-OH no intervalo de 1000-1104 cm^-1 e PO₄ em 573 cm^-1, que pode ser também atribuída à fase amorfa de fosfato de cálcio, confirmando os resultados obtidos por DRX. Bandas de apatita carbonatada do tipo A apareceram em 1457 e 1528 cm^-1.

A presença do íon Mg²⁺ na solução possibilitou a obtenção de OCP, pois favoreceu a cristalização completa do ACP, por diminuição do t_ACP, e, conseqüentemente, sua transformação parcial a OCP.

Recobrimento por SBF 3

O recobrimento obtido por imersão em SBF 3 apresentou morfologia predominante de fosfato de cálcio amorfo, resultado confirmado por DRX, Figura 4. A razão Ca/P foi de 1,42. O espectro de IV apresentou bandas características dos grupos P-OH em 944-1119 cm^-1, PO₄ em 573 cm^-1, que pode ser atribuída também à fase amorfa de fosfato de cálcio, e apatita carbonatada do tipo A em 1457 e 1528 cm^-1.O comportamento desta solução assemelhou-se à solução SBF 1, indicando a não interferência do íon K⁺ em t_ACP.

Recobrimento por SBF 4

Por imersão em SBF 4 obteve-se um recobrimento composto por grãos esféricos característicos de fosfato de cálcio amorfo. A razão Ca/P foi de 1,5. Os resultados do DRX confirmaram a presença majoritária ACP, Figura 5. O fenômeno de formação desta fase é semelhante ao ocorrido pela imersão das amostras em SBF 1 e 3, ou seja, a composição da solução não possibilitou a redução de t_ACP, interferindo desta forma na sua conversão a outras fases de apatita. O espectro de IV exibiu bandas características dos grupos PO₄ (em 564 cm^-1), P-OH (em 944 -1119 cm^-1) e apatita carbonatada do tipo A e B (em 1536 e 1468 cm^-1, respectivamente).

Recobrimento por SBF 5

O recobrimento obtido pela imersão em SBF 5 apresentou morfologia característica das fases ACP e OCP, ou seja, composto por grãos esféricos e cristais em forma de agulhas. Estas observações foram confirmadas pela análise do DRX, o qual apresentou picos característicos destas fases, Figura 6. A presença dos elementos Ca e P deu-se em uma razão de 1,46. O espectro de IV apresentou bandas dos grupos PO₄ em 465 e 593 cm^-1, P-OH em 944-1119 cm^-1, apatita carbonatada do tipo A em 880 e 1457 cm^-1 e apatita carbonatada do tipo B em 870 cm^-1, que pode também ser atribuída ao grupo PO₄.

Pode-se notar que o íon CO₃^2- na concentração de 3 mM possibilitou a cristalização completa do ACP, favorecendo, dessa forma, sua conversão parcial a OCP.

Recobrimento por SBF 6

O recobrimento obtido por imersão nesta solução apresentou em sua morfologia aglomerados entre partículas esféricas maiores que aquelas características da fase ACP e agulhas características do OCP. A presença dos elementos Ca e P deu-se em uma razão de 1,53. Os resultados de DRX confirmaram as observações anteriores, pois apresentaram picos característicos somente da fase OCP e de apatita carbonatada AB, Figura 7. Dessa forma, nota-se que nesta concentração (5 mM) os íons CO₃^2- apresentam maior eficiência na diminuição do período de indução da cristalização do ACP. As bandas exibidas por espectroscopia de IV foram características dos grupos PO₄ (em 454, 544 e 595 cm^-1), P-OH (em 879 e 944-1095 cm^-1) e apatita carbonatada dos tipos A e B (em, respectivamente, 1547 e 1311, 1468 cm^-1).

A elevada concentração do íon CO₃^2- nesta solução possibilitou, além da cristalização completa do ACP, sua conversão total a OCP.

CONCLUSÃO

Os resultados obtidos neste trabalho confirmam a influência da composição da solução biomimética na obtenção de diferentes fases de apatita. A cristalização de ACP foi possível com a utilização de todas as soluções em estudo, sendo que a composição de tais soluções determinou a presença desta fase como majoritária ou como mistura juntamente com OCP ou ainda na sua conversão direta a OCP. A presença majoritária de ACP no recobrimento só foi observada quando se utilizou soluções contendo os íons K⁺ e SO₄^2-, tendo em vista que estes íons não alteraram t_ACP. A conversão desta fase a OCP somente foi possível com a presença dos íons Mg²⁺ e CO₃^2-. O comportamento do íon CO₃^2- tornou-se acentuado na concentração de 5 mM, onde foi observada a conversão direta de ACP a OCP.

MATERIAL SUPLEMENTAR

No material suplementar, disponível gratuitamente em http://quimicanova.sbq.org.br na forma de arquivo PDF, estão contidas as Figuras referentes a MEV, EDX e IV dos recobrimentos obtidos, Figuras 1S a 7S.

Recebido em 15/5/06; aceito em 29/9/06; publicado na web em 28/5/07

Material Suplementar

Datas de Publicação

Histórico