Inactivation mechanisms and resistance properties of Bacillus spores during cold atmospheric pressure plasma treatment
Hertwig, Christian
Kaltes Atmosphärendruckplasma (KADP) ist eine vielversprechende und innovative nichtthermische Technologie zur Inaktivierung von Mikroorganismen auf verschiedenen Oberflächen. Plasmaanwendungen werden in der Lebensmittelindustrie schon seit Jahrzehnten eingesetzt, z.B. zur Generierung von ultraviolettem (UV) Licht oder zur Erzeugung von Ozon. In den letzten Jahren fand die KADP Anwendung zur Inaktivierung von bakteriellen Sporen mehr Beachtung. Die Inaktivierungsmechanismen bakterieller Sporen sind komplex und bisher noch nicht vollständig verstanden. Sie hängen von den verschiedenen generierten Bestandteilen des Plasmas ab. Ziel dieser Arbeit war es, die Inaktivierungsmechanismen von Bacillus Sporen bei der Plasmabehandlung zu untersuchen. Des weiteren wurde der Einfluss bestimmter Prozessparameter, wie die Plasmaquelle, Prozessgase und deren Mischungen, sowie produktbezogene Parameter, wie die Struktur der Oberfläche und die Verteilung der Sporen auf dieser, auf den Inaktivierungsprozess untersucht.
Die verwendeten Plasmen wurden detailliert charakterisiert, durch die Verwendung von optischer Emissionsspektrometrie, faseroptischen Temperatursensoren und die Quantifizierung der generierten reaktiven Plasmakomponenten. Um den Einfluss verschiedener Prozessgase auf die Inaktivierung zu verstehen, wurde eine quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) Analyse verwendet um den Effekt der Plasmabehandlung auf die DNA der Sporen zu untersuchen. Verschieden Oberflächen, von einer ebenen, glatten Glasoberfläche, zu einem runden, glatten Model bis zu einem reellen Lebensmittel (schwarze Pfefferkörner), wurden KADP behandelt, um den Einfluss der Oberfläche, auf welcher die Sporen vorliegen, auf den Inaktivierungsprozess zu untersuchen. Weiterhin wurde die Inaktivierung von isogen mutierten Sporenstämme untersucht, denen verschiedene Faktoren wie die äußere Sporenhülle und die kleinen säurelöslichen Proteine (SASP), sowie die Dipicolinsäure (DPA) im Sporenkern fehlen.
Durch diese Methoden konnte in dieser Arbeit ein umfangreicher Einblick in die Inaktivierung von Bacillus Sporen durch KADP gegeben werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Prozess- und produktbezogenen Parameter den Inaktivierungsprozess beeinflussen. Die vom Plasma emittierten UV Photonen sind von wesentlicher Bedeutung für die Sporeninaktivierung. Durch die Verwendung bestimmter Prozessgase oder Mischungen, wie Stickstoff, kann die Menge der UV Emissionen optimiert werden. Weiterhin beeinflusst das Prozessgas oder die Mischung, und dementsprechend auch die Zusammensetzung des Plasmas, den Prozess der Sporeninaktivierung. Die Verwendung von KADP mit einer hohen UV Emission verursacht einen hohen Grad an DNA-Schäden bei der Sporeninaktivierung. Die Oberfläche, auf der die Sporen vorliegen, hat ebenfalls einen großen Einfluss auf die Inaktivierung. Eine komplexe Oberflächenstruktur, wie bei schwarzen Pfefferkörnern, reduziert den antimikrobiellen Effekt der KADP-Behandlung wesentlich, vermutlich durch Schatteneffekte für die generierten Plasmakomponenten. Die Verteilung der Sporen auf der Oberfläche beeinflusst auch die Inaktivierung. Liegen die Sporen einzeln verteilt auf der Oberfläche vor, können sie schnell durch KADP mit einer hohen UV Emission inaktiviert werden. Wohingegen Sporenagglomerate die Inaktivierung erschweren, wahrscheinlich auf Grund der begrenzten Eindringtiefe der UV Photonen. Jedoch kann die Verwendung von einem KADP mit einem hohen Gehalt an reaktiven und metastabilen Partikeln die Inaktivierung durch die Zersetzung der Sporen fördern. Darüber hinaus wurden verschiedene Faktoren der Spore, die äußere Sporenhülle, die Sättigung der DNA mit SASPs und die DPA im Kern der Spore, identifiziert, die zur Resistenz der Spore gegenüber KADP beitragen.
Die in dieser Arbeit erhaltenen Daten ermöglichen ein erweitertes Verständnis der Sporeninaktivierung auf verschieden Oberflächen durch KADP und können zur Optimierung für zukünftige plasma-basierte Inaktivierungskonzepte in der Lebensmittelindustrie beitragen.
Cold atmospheric pressure plasma (CAPP) is a promising and innovative emerging non-thermal technology for the inactivation of microorganisms on various surfaces. Plasma applications have already been used in the food industry at industrial scale for decades to generate e.g. ultraviolet (UV) light or ozone. In recent years, the inactivation of bacterial spores using CAPP has attracted more attention. The mechanisms leading to spore inactivation are complex, depending on the different generated components of the plasma and have not been fully understood yet. This study aimed to improve the understanding of the CAPP-based mechanisms responsible for Bacillus spore inactivation. Moreover, it was investigated how the different process parameters, such as plasma source, process gases and mixtures, and product related parameters, like the structure of the surface the spores are attached to and spore distribution on the surface, influence the inactivation process.
The different tested plasmas were characterized in detail using optical emission spectroscopy, fiber-optic temperature sensors and the quantification of the generated reactive components. To understand how the different process gases inactive the spores, a quantitative realtime polymerase chain reaction (qPCR) assay was used to detect the effect of the plasma treatment on the spore DNA. Different surfaces, from an even and smooth glass surface via a spherical and smooth model to a real food matrix (whole black peppercorns) were CAPP treated to investigate the effect of the surface, the spores are attached to, on the inactivation process. A detailed knowledge about the spore properties responsible for their resistance towards CAPP was obtained by using different isogenic mutant spore strains, which are lacking different factors, such as the outer spore coat, as well as the small acid soluble protein (SASP) and the dipicolinic acid (DPA) inside the spore coat.
Due to the various used methods, a comprehensive insight into the Bacillus spore inactivation by CAPP was given within this study. It was also shown how the process and product related parameters influence the inactivation process. Emitted UV photons of the plasma are of high importance for the spore inactivation. The amount of UV emissions can be optimized by the use of certain process gases or mixtures, such as N2. Furthermore, the composition of the process gas, thus the composition of the generated plasma components, influence the process of spore inactivation. CAPP with a high UV emission caused a high degree of DNA damage during the spore inactivation. The surface, the spores are attached to, also affect the inactivation efficiency tremendously. A complex surface structure, like on black peppercorns, lowers the antimicrobial effect of a CAPP treatment significantly, probably due to shadow effects for the generated plasma components. It was also shown, that the distribution of spores on the surface affects the inactivation. Spores present in a monolayer can be fast inactivated by CAPP with a high emission of UV photons. Spore agglomerates hamper the inactivation, probably due to the limited penetration depth of UV photons. However, using a CAPP with a high content of reactive and metastable species can support the inactivation by the decomposition of the spores. Moreover, it could be shown that different spore properties, such as the outer spore coat, saturation of the DNA with SASPs and the DPA inside the spore core, are responsible for the Bacillus spore resistance towards CAPP.
The obtained data from this work will lead to a better understanding of the CAPP-based spore inactivation on different surfaces and can aid to optimize future plasma-based inactivation concepts in the food industry.
