1. 引言
孤独症谱系障碍(autistic spectrum disorder, ASD)是一组以社交沟通障碍、兴趣或活动范围狭窄及重复刻板行为为主要特征的神经发育性障碍 [1]。2013年5月18日美国精神医学协会在发布的精神障碍诊断与统计手册第五版(DSM-Ⅴ)中正式提出ASD的概念，包括儿童孤独症、Asperger综合征、Rett综合征、儿童瓦解性精神障碍、广泛性发育障碍等5种亚型 [2]。在过去孤独症一直被人们视为罕见病，但现在随着诊断标准等变化，其发生率越来越高。美国疾病控制与预防中心(centers for disease control and prevention, CDC)近年来的数据表明美国8岁儿童ASD患病率由2008年的1/88已升至现在的1/54，也就是说在54个儿童中就有一名ASD儿童 [3]。ASD儿童的核心症状及伴随症状对儿童本身、家庭及社会均带来沉重负担，改善ASD儿童的症状，提高其生活质量至关重要，但目前其发病机制仍不明确，治疗效果欠佳。
近年来叶酸与神经精神疾病的相关性研究越来越多。叶酸作为一种水溶性B族维生素，自身不能合成，必须通过外界补充来获得。研究发现叶酸缺乏不光会导致胚胎期神经管发育异常，还可能会影响大脑功能，有研究证实多种精神疾病的发生与体内叶酸水平存在相关性 [4]。叶酸在人体内代谢过程比较复杂，在循环或者转运过程中出现问题，均可能与ASD发病相关 [5]。本文将从叶酸水平与孤独症谱系障碍严重程度的相关性入手，探讨两者之间的关系，更好的改善ASD儿童的生活质量。
2. 研究方法
2.1. 研究对象
2.1.1. ASD儿童组
纳入2018年9月至2019年9月来自超然学堂、小蜗牛成长乐园、李沧星语教育中心等培训机构及就诊于青岛大学附属医院儿童保健科确诊的ASD儿童作为ASD组。纳入标准：① 符合《美国精神病障碍诊断与统计手册》(DSM-V)中ASD的诊断标准；② 社交反应量表(Social Responsiveness Scale, SRS)、行为检查量表(Autism Behavior Checklist, ABC)、儿童孤独症评定量表(Childhood Autism Rating Scale, CARS)筛查量表阳性；③ 无神经系统疾病如癫痫等，头颅MRI、脑电图未见明显异常；④ 年龄在2~7岁。排除标准：① 患有精神行为疾病或染色体、遗传代谢性疾病及其他重大躯体疾病者；② 监护人不愿意参加者；③ 近1周内患急性疾病或服用药物者。共收集有效问卷113例。
2.1.2. 正常对照儿童组
纳入2018年9月至2019年9月于青岛大学附属医院儿童保健科进行儿童保健及幼儿园的2~7岁正常儿童作为正常对照组。排除标准：① 伴神经发育性疾病及其他急慢性疾病者；② 近1周内患急性疾病或服用药物者；③ 监护人不愿意参加者。共收集有效问卷133例。
本研究获得医院伦理委员会的同意及批准，所有受调查儿童的家长均签署知情同意书。
2.2. 检测方法
所有研究对象均于清晨采集3~4 ml空腹血，置于分离胶普通管中，检测仪器为迈瑞全自动化学发光免疫分析仪，采用化学发光免疫分析方法检测每个研究对象的血清叶酸水平。
2.3. 病情评估量表
儿童孤独症评定量表(CARS量表)共15项，包括人际关系、模仿、情感反应、躯体运用能力、与非生命物体的关系、对环境变化的适应、视觉反应、听觉反应、近处感觉反应、焦虑反应、语言交流、非语言交流、活动度、智力功能、总体印象。每个项目1~4分不等，总分15~60分，总分在30~36分之间为轻中度，≥36分为重度孤独症 [6]。其信效度分析均良好 [7]。
2.4. 统计学方法
使用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布，采用均数 ± 标准差(
± S)描述，并用独立样本t检验进行组间比较；若不符合正态分布，则以中位数(百分位数) [M(P25, P75)]表示，并使用非参数检验比较组间差异。计数资料采用构成比、百分数(%)描述，用c2检验或Fisher确切概率法进行组间比较。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2.5. 质量控制
血清学标本由青岛大学附属医院专业人员统一采集，检测仪器为迈瑞全自动化学发光免疫分析仪，采用化学发光免疫分析方法分析研究对象的叶酸值。儿童孤独症评定量表在青岛大学儿童保健科医生指导下儿童家属填写完成。并向家属介绍调查目的、要求、注意事项及保密原则。填写后由专业人员进行审核，对填写有误、遗漏、信息模糊的内容进行现场更正及补充。
3. 结果
3.1. 两组儿童血清叶酸水平比较
两组儿童叶酸水平差异具有统计学意义，其中ASD儿童叶酸水平低于对照组儿童(12.25 ± 4.09 vs. 14.53 ± 2.88, P < 0.05)，见表1。
3.2. 不同症状严重程度ASD儿童血清叶酸水平比较
根据CARS量表评分，按照总分在30~36分之间为轻中度，≥36分为重度的标准，将其分为轻中度组和重度组，，两组间叶酸水平差异具有统计学意义(P < 0.05)，且重度组叶酸水平要低于轻中度组水平(12.11 ± 3.87 vs. 12.47 ± 4.14)，见表2。
Table 1. Comparison of serum folate levels between the two groups (
± S)
表1. 两组儿童血清叶酸水平比较(
± S)
Table 2. Comparison of serum folate levels in children with ASD of different severity (
± S)
表2. 不同严重程度症状ASD儿童血清叶酸水平比较(
± S)
3.3. ASD儿童叶酸水平与CARS评分的相关性分析
目前结果可知，ASD儿童的叶酸水平，与CARS评分呈负性相关。(r = −0.002, P < 0.05)，见表3。
Table 3. Correlation between folic acid level and CARS score in children with ASD
表3. ASD儿童叶酸水平与CARS评分的相关性
4. 讨论
目前孤独症谱系障碍的病因不明，人们认为是遗传基因、社会环境等综合因素所致。多项研究发现患有孤独症谱系障碍的儿童叶酸水平常低于正常儿童。孙彩虹等人在孤独症儿童膳食与营养研究中发现ASD儿童的叶酸水平低于正常组 [8]，马燕等人也发现ASD儿童的叶酸水平低于正常儿童，且与ASD儿童的疾病严重程度相关 [9]。在本研究中ASD儿童的血清叶酸水平低于对照组(12.25 ± 4.09 vs. 14.53 ± 2.88, P < 0.05)，与既往研究结果相一致。
有研究认为叶酸缺乏会影响神经精神的发育，可能是孤独症谱系障碍的发病的原因之一 [10]。叶酸究竟是通过什么途径来影响儿童的神经发育的呢？目前很多研究从叶酸代谢、叶酸转运等多个代谢步骤做出解释。叶酸作为B族水溶性维生素，因不能在体内合成，通过外界补充进入肠道后需要相应的载体进入血液，并在还原性载体(reduced folate carrier, RFT)及叶酸受体(folate receptor, FR)作用下进入血脑屏障 [11]，进一步发挥作用。最近脑叶酸缺乏症(CFD)被认为与孤独症谱系障碍(ASD)的发病有关 [12]。国外研究进一步证实叶酸是胎儿和婴儿发育期间必不可少的营养素，其认为抗叶酸受体α的自身抗体可以阻止叶酸从母亲向胎儿以及婴儿向大脑的运输，在对患有ASD的儿童及其直系亲属评估后发现自身抗体在患病家庭中非常普遍 [13]。叶酸和维生素B12依赖性酶蛋氨酸合酶(MS)对细胞氧化状态高度敏感，较低的MS活性会增加抗氧化剂谷胱甘肽的产量，同时会减少200多个甲基化反应，从而广泛影响代谢活性 [14]。亚甲基四氢叶酸还原酶(methyleneter-hydrofolate reductase, MTHFR)作为叶酸代谢的关键酶，在蛋氨酸循环中起着重要作用,赵栋等人发现ASD儿童MTHFR基因C677T点突变率明显高于正常儿童 [15]，另有研究证实了MTHFR基因突变在中国汉族中与孤独症患病风险相关联 [16] [17]，考虑MTHFR基因突变影响DNA甲基化，进一步影响孤独症的患病风险。
本文中研究还发现ASD儿童叶酸水平与CARS评分呈负性相关，进一步说明叶酸与ASD儿童病情程度相关性，这也为我们预防或改善ASD提供了一定的思路。国外一项研究发现母亲孕期高摄入量叶酸可降低ASD发病的风险 [18]。李楠楠等人发现ASD儿童在参与结构化教学的同时补充叶酸，对认知和语言交流的改善作用优于单纯参与结构化教学 [19]。有研究通过大鼠实验得出叶酸受体α (FRα)自身抗体与胎儿异常和脑叶酸缺乏的发育障碍有关。超过70%的孤独症谱系障碍(ASD)儿童这些自身抗体呈阳性，而高剂量亚叶酸对治疗这些儿童有益，研究发现使用高剂量亚叶酸进行治疗以及降低自身抗体滴度的其他干预措施是可以降低患有发育缺陷儿童风险的有效策略 [20]。国外一项针对伴有语言障碍的ASD儿童研究中发现与安慰剂相比，用高剂量亚叶酸治疗12周可改善交流能力，特别是那些对叶酸受体-α自身抗体(FRAAs)呈阳性的儿童 [21]。
总之，孤独症谱系障碍儿童的叶酸水平均低于正常儿童，且与其严重程度相关。目前对叶酸影响ASD的发病及严重程度和补充叶酸是否改善ASD儿童的症状的研究尚不充分，仍需要我们继续研究两者的临床关系，为找到ASD发病的原因找到更强有力证据。