Presença de Listeria monocytogenes em Queijos de Pasta Mole da Região a Sul do Tejo

A contaminação microbiológica dos alimentos pode contribuir para a transmissão de doenças de origem alimentar, as quais representam um problema de saúde com grande impacto a nível mundial [1].

Os patogénicos de origem alimentar são microrganismos capazes de infetar os seres humanos pelo consumo de alimentos e águas contaminados, provocando diferentes sintomas [2-4] (ex. náuseas, vómitos, diarreia, mal-estar, febre e dores abdominais) que em alguns casos podem evoluir e originar sequelas mais graves por vezes fatais. As toxinfeções alimentares são um grupo de doenças de origem alimentar que incluem: (1) infeções alimentares: causadas pela ingestão de agentes infeciosos vivos; (2) intoxicações alimentares: provocadas pela ingestão de toxinas microbianas formadas nos alimentos antes do seu consumo; (3) toxinfeções: originadas pela ingestão de um alimento que contenha microorganismos patogénicos, que produzem toxinas dentro dos intestinos [2].

As bactérias mais frequentemente reportadas como causadoras de doenças de origem alimentar são a Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Campylobacter spp. e Bacillus cereus [5].

Devido à severidade e elevada taxa de mortalidade da listeriose humana [5], é fundamental em saúde pública a deteção de Listeria monocytogenes em alimentos prontos para consumo, nomeadamente em queijos de pasta mole, dado estarem descritos surtos e casos esporádicos de listeriose associados a este tipo de produtos, mantidos em condições de refrigeração e durante um determinado período de vida útil.

A Listeria monocytogenes é uma bactéria Gram-positiva com a capacidade de se multiplicar em ambientes adversos. É conhecida e estudada desde 1924 por Murray et al. [6], sendo a única espécie reconhecida do género Listeria até cerca de 1961. Estão atualmente estudadas 10 espécies: L. monocytogenes, L. innocua, L. welshimeri, L. seeligeri, L. grayi e L. ivanovii e mais recentemente L. marthii, L. rocourtiae, L. fleischmannii, e L. weihenstephanensis, sendo os casos de infeção em humanos quase exclusivamente causados pela espécie L. monocytogenes [1].

Esta espécie pode originar quadros clínicos de septicemia, gastroenterite, meningite e encefalite. Os grupos de maior risco incluem crianças, indivíduos imunodeprimidos, grávidas e idosos [7]. Segundo Mylonakis et al. [8] e Lamont et al. [9], durante a gravidez a infeção com Listeria monocytogenes pode ter consequências graves, incluindo aborto, morte fetal e materna, parto prematuro, e sépsis neonatal [10]. A evolução da doença depende principalmente da quantidade de bactérias ingeridas, da virulência da estirpe e da suscetibilidade do hospedeiro. Deste modo, é difícil determinar a dose infeciosa mínima de patogénico para provocar doença [10, 11]. Numa fase inicial os sintomas são semelhantes aos manifestados em outras gastroenterites de origem alimentar (listeriose não invasiva). No entanto a capacidade para atravessar barreiras fisiológicas como a placenta, o intestino e a barreira hematoencefálica aumenta a severidade da doença (listeriose invasiva).

O período de latência da doença pode ser longo, estando descrito por diferentes autores um período médio de 8 dias para a listeriose invasiva mas podendo variar de 1 a 67 dias [12, 13].

Esta bactéria pode estar presente no meio ambiente, sendo transmitida principalmente pela via alimentar. Diferentes tipos de alimentos têm sido associados a surtos de listeriose, como carnes, peixes fumados, saladas, leite e produtos derivados não pasteurizados nomeadamente queijos de pasta mole, vegetais, produtos de charcutaria, alimentos prontos a comer e alimentos processados [1, 14]. Para além dos alimentos poderem ser fonte de contaminação também o ambiente de processamento (utensílios utilizados na sua preparação e os equipamentos associados ao fabrico), pode ser um veículo de contaminação se a higienização e desinfeção não forem eficazes [15]. A Listeria monocytogenes apresenta grande capacidade para se alojar em locais onde é difícil a penetração dos detergentes e desinfetantes, aderindoàs superfícies dos equipamentos e formando biofilmes que as protegem de condições ambientais adversas [16].

A prevenção da listeriose pode ter diferentes abordagens: (a) cozinhar bem alimentos crus de origem animal (ex. carnes bovinas, suínas e de aves); (b) lavar os vegetais crus completamente em água corrente antes de comer, separar alimentos cozinhados de alimentos crus; (c) não beber leite cru e não comer alimentos que têm leite não pasteurizado neles; (d) lavar as mãos, facas, bancadas, e tábuas de corte após o manuseamento e preparação de alimentos não cozidos; (e) consumir alimentos perecíveis e prontos-a-comer o mais rapidamente possível. Nos Estados Unidos da América adotou-se uma política de tolerância zero para a presença de Listeria monocytogenes nos alimentos prontos para consumo. Na Europa, segundo o Regulamento (CE) no 2073/2005 [17], é permitida a presença de Listeria monocytogenes até ao limite de 100 ufc/g em alimentos prontos para consumo (onde se incluem os queijos de pasta mole) colocados no mercado durante o seu período de vida útil. No fim do processo de fabrico dos alimentos suscetíveis de permitir o crescimento de Listeria monocytogenes, é exigida a ausência de Listeria monocytogenes em 25 g no momento que o alimento deixa de estar sob o controlo do operador da empresa do setor alimentar que o produziu. A exceção ocorre quando o produtor tem a capacidade para demonstrar que o produto não excederá o limite de 100 ufc/g até ao fim do seu período de vida útil.

A notificação de listeriose em humanos é obrigatória na maioria dos Estados Membros. Em Portugal esta doença é de declaração obrigatória [18] desde abril de 2014, no entanto os dados disponíveis no que se refere ao número de surtos são muito reduzidos a nível nacional. Em 2009, Almeida et al. [19] publicaram um artigo onde descrevem todos os casos diagnosticados em Portugal no período de 2004 a 2007. Identificaram-se 67 casos, sendo que dos 24 casos para os quais foi conhecida a evolução clínica, 40% foram fatais [19]. No ano de 2007 em Portugal, estimou-se uma taxa de incidência de 2,3 casos por milhão de habitantes, sendo este valor semelhante à taxa de incidência verificada na Áustria, Estónia, Letónia, Eslováquia e Eslovénia [20].

Em Portugal existe uma forte tradição no consumo de produtos regionais de charcutaria, nomeadamente de queijos de pasta mole. Este alimento pelas matérias primas utilizadas (ex. leite cru) ou durante o processo de fabrico pode ser um veículo de contaminação de Listeria monocytogenes se a higienização e desinfeção não forem eficazes. O presente estudo teve como objetivo a deteção e quantificação de Listeria monocytogenes em queijos de pasta mole produzidos na região a Sul do Tejo, uma das regiões portuguesas com tradição na produção deste tipo de queijos.

No presente trabalho foram analisadas 30 amostras de queijo de diferentes fabricantes, adquiridos em seis grandes superfícies comerciais da região de Lisboa. As amostras foram recolhidas entre os meses de março e abril de 2014 e transportadas em mala isotérmica para o Laboratório de Microbiologia do Departamento de Alimentação e Nutrição (DAN) do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, I.P. (INSA). Todos os queijos foram devidamente identificados e codificados de acordo com a origem do leite, tratamento térmico, matéria gorda e origem geográfica (Tabela 1).

As amostras foram recolhidas seguindo regras de assepsia numa câmara de fluxo laminar Vertical classe ISO5 marca Microflow® e modelo 20134 (Astec, Andover, UK). O exterior de todas as amostras embaladas, foi desinfetado com etanol a 70% (v/v) e efetuada a colheita de uma porção de cerca de 100 g para sacos estéreis identificados de 1 a 30. Cada amostra foi recolhida numa proporção de 10% de casca e 90% de massa. De seguida foram efetuadas as diluições iniciais da amostra (Fig. 1) em ambiente controlado e com material estéril. Depois, as amostras foram homogeneizadas durante 1 min a 230 rpm, num agitador peristáltico da marca Stomacher®, modelo 400 Circulator (Seward Limited, London, UK).

Foi utilizado um método normativo [21, 22] para a contagem de Listeria spp. (incluindo Listeria monocytogenes) estando o referido procedimento descrito na Figura 1a. A diluição inicial da amostra (1 × 10^–1) foi efetuada com água peptonada tamponada, a partir de uma toma de 10 g utilizando um diluidor automático marca IUL Instruments, modelo Pinch Diluter, (Seward Limited, London, UK). A amostra foi colocada a 20 ± 2°C durante 1 hora em banho de água da marca Grant, modelo OLS200 (Grant Instruments, Cambridge, UK). O meio de cultura utilizado para a quantificação foi o meio seletivo COMPASS Listeria agar, (Biokar®, Beauvais, France). Neste meio as bactérias do género Listeria spp., crescem desenvolvendo colónias azuis esverdeadas pela ação da enzima β-glucosidase sobre o X-glucosido. Para efetuar a identificação de Listeria spp. e de Listeria monocytogenes selecionaram-se 5 colónias características de cada placa contável.

Para a identificação das estirpes de Listeria, realizaram-se as provas da catalase, coloração de Gram e hemólise a partir das colónias suspeitas obtidas nos meios seletivos. A identificação bioquímica das estirpes de Listeria foi efetuada no equipamento da marca Vitek® (bioMérieux® 185 SA, Marcy l’Étoile, France), sistema automatizado para identificação bacteriana.

Para a pesquisa de Listeria monocytogenes foi utilizado o método Vidas® LMO2, sendo a confirmação efetuada por um método normativo [22, 23]. Na Figura 1b está esquematizado o procedimento de pesquisa de Listeria monocytogenes. Para efetuar esta deteção, foram pesadas 25 g de amostra numa balança digital da marca Mettler Toledo, modelo PM 2000 (Mettler-Toledo AG, Laboratory and Weighing Technologies, Greifensee, Switzerland) e adicionadas de 225 mL Caldo Fraser meia concentração, seguido de um novo enriquecimento em Caldo Fraser. Após a etapa de enriquecimento, a deteção foi efetuada por um método imunoenzimático, no sistema automatizado Vidas® LMO2 (bioMérieux® SA, Marcy l’Étoile, France), tecnologia Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA). Nas amostras com resultados positivos efetuaram-se provas de confirmação no sistema Vidas® de acordo com o procedimento referido anteriormente e descrito na norma ISO 11290-1:1996/Amd 2004.

O leite de ovelha sem tratamento térmico representou cerca de 70% (n = 21) da matéria-prima utilizada na produção dos queijos analisados (Tabela 1), seguido do leite de mistura pasteurizado. Dos 30 queijos de pasta mole estudados, nove apresentaram Listeria spp., e destes, quatro apresentaram Listeria monocytogenes. Das amostras com Listeria monocytogenes, três apresentaram níveis superiores ao valor máximo admissível [24] (100 ufc/g) e uma inferior ao Limite de Deteção (10 ucf/g) do método de contagem (Tabela 2).

Três dos queijos positivos para Listeria monocytogenes provinham de leite de ovelha cru, sendo que um deles evidenciou a presença de três diferentes espécies de Listeria (L. monocytogenes, L. innocua e L. welshimeri) em simultâneo (Tabela 2). Em cinco dos 30 queijos analisados foi detetada a espécie Listeria innocua (Tabela 2), considerada por alguns autores [25, 26] como indicador da possível presença de Listeria monocytogenes, contudo esta estirpe não foi detetada nestas amostras. Num único queijo de cabra, cujo leite sofreu tratamento térmico elevado (cerca de 95°C), foi também detetada a presença de Listeria innocua. Embora estejam disponíveis dados sobre a prevalência de Listeria monocytogenes em queijos de pasta mole [5], são poucos os estudos realizados na Europa que têm como objetivo principal detetar e quantificar a Listeria monocytogenes neste tipo de queijos. Ao comparar os resultados obtidos com os encontrados na literatura científica para queijos de pasta mole, verificou-se que num estudo publicado em 2012, cujo objetivo foi a determinação da prevalência de Listeria em queijos de pasta mole provenientes de diferentes produtores no País Basco, os resultados foram negativos para Listeria monocytogenes em 51 amostras de queijos analisadas. No entanto, 9,8% dos queijos apresentaram resultados positivos para Listeria spp., não sendo identificada a espécie de Listeria que estava na origem dessa percentagem [27].

Num outro estudo, realizado em 2011 em Itália, foram analisados 50 queijos de pasta mole, em que não foi detetada a presença de Listeria monocytogenes em nenhuma das amostras [28]. Em 2013 no Japão devido ao crescente consumo de queijo observado naquele país, foi efetuado um estudo em 126 queijos, 33 dos quais de pasta mole mas em nenhum foi detetada a presença de Listeria monocytogenes [29].

Nas amostras de queijo do presente estudo em que foi detetada a presença de Listeria monocytogenes, as causas da contaminação podem ser várias nomeadamente a origem do leite utilizado, o processo de fabrico (ex. a recontaminação após tratamento térmico do produto, tratamento térmico insuficiente e condições de armazenamento), a distribuição ou a comercialização. É de salientar que dos três queijos em que foi detetada a presença de Listeria monocytogenes acima do valor máximo admissível [23], um era um produto de Denominação de Origem Protegida. Num dos queijos fabricado com leite tratado termicamente, foi detetada Listeria innocua, o que alerta para a importância do controlo de outros pontos críticos no fabrico dos queijos, para além do tratamento térmico do leite para minimizar/eliminar a contaminação por Listeria monocytogenes. De acordo com o dados publicados no relatório do Centers for Disease Control and Prevention (CDC) [30], os surtos atribuídos a queijos entre 1998 e 2011 ocorreram devido tanto à utilização de leite não pasteurizado para o fabrico dos queijos, bem como pela contaminação pós-pasteurização. No entanto, os queijos de pasta mole produzidos a partir de leite não pasteurizado estão associados a um risco 50 a 160 vezes superior de ter Listeria monocytogenes do que os produzidos a partir de leite pasteurizado [31].

Os resultados deste estudo estão em conformidade com as conclusões dos relatórios do CDC que alertam para a importância da implementação de sistemas de segurança alimentar, contribuindo assim para a prevenção da ocorrência de listeriose nos consumidores deste tipo de produtos (especialmente em grupos e risco), nomeadamente através da utilização de leite pasteurizado, implementação de um sistema de Hazard Analysis and Critical Control Point (HACCP) que diminua os riscos associados à contaminação pós-processamento como no manuseamento e corte dos queijos.

Este estudo teve como principal limitação a baixa representatividade da amostragem. De futuro pretende-se adquirir queijos não apenas em grandes superfícies comerciais, mas também diretamente ao fabricante para a realização de um estudo comparativo e verificar se os produtores das marcas dos queijos contaminados com Listeria spp. possuem sistemas de segurança alimentar implementados e efetivos.

Os queijos podem ser veículos potenciais de Listeria monocytogenes e constituir um risco para o consumidor. De acordo com o padrão encontrado, os queijos de pasta mole produzidos na região do Sul do Tejo contaminados com Listeria monocytogenes foram produzidos a partir de leite sem tratamento térmico. Estes resultados evidenciam que o consumo deste tipo de produtos está associado a um aumento da probabilidade de ocorrência de listeriose, especialmente nos grupos mais vulneráveis. O incumprimento das Boas Práticas de Higiene no fabrico, distribuição e comercialização dos queijos aumenta o risco da presença de Listeria monocytogenes neste tipo de produtos. A segurança alimentar dos queijos de pasta mole pode ser garantida através da aplicação de Boas Práticas de Higiene e da utilização de combinações adequadas dos diferentes factores de segurança alimentar como sendo, o pH, a atividade da água, concentração de sal e condições de tempo/temperatura ao longo do processo.

Os autores agradecem à Dra. Maria Antónia Calhau, Coordenadora do Departamento de Alimentação e Nutrição (DAN) no INSA por autorizar a realização deste trabalho de investigação aplicada e a toda a equipa do laboratório pela colaboração prestada durante o desenvolvimento do presente estudo.