修回日期: 2006-10-20
接受日期: 2006-10-25
在线出版日期: 2007-01-08
目的: 观察食用白酒灌胃后, 大鼠胃黏膜对无水乙醇损伤的反应及前列腺素E2(PGE2)、转化生长因子α(TGF-α)的表达情况.
方法: SD大鼠36只, 分别采用食用白酒530±20 mL/L(A组), 乙醇530 mL/L(B组)、生理盐水(C组)按5 mL/kg隔日给大鼠灌胃, 在1 wk末、1 mo末处死动物, 对比观察胃黏膜的Guth积分; 用免疫组织化学方法测定胃黏膜中TGF-α的表达强度. 另取36只大鼠, 按以上相同处理后用酶联免疫方法测定胃黏膜中PGE2水平.
结果: 胃黏膜损伤程度由轻到重依次为A, B, C组, A, B, C组1 wk Guth积分分别为26.5±6.4, 40.5±8.1, 69.3±4.3, 两两比较均有统计学差异(P<0.05); A, B, C组1 mo Guth积分分别为34.8±8.0, 54.8±8.0, 74.8±3.1, 两两比较均有统计学差异(P<0.05). 1 wk A, B组胃黏膜组织内PGE2水平与C组相比明显增高(17.2±1.8, 16.6±1.1 ng/L vs 13.0±1.5 ng/L, P<0.05), A组与B组相比无差异(P>0.05); 1 mo后A组PGE2值下降, 与C组相比无差异(P>0.05), 而A, C组与B组相比均有差异(15.7±1.4, 14.6±1.9 ng/L vs 18.5±2.7 ng/L, P<0.05). TGF-α表达1 wk A, B组与C组有统计学差异(均P = 0), A组与B组无差异; 1 mo A, B, C组两两比较有差异(P = 0.013, 0.001, 0). PGE2水平、TGF-α表达强度1 wk与1 mo比较, 在A, C组差异有统计学意义(P<0.05); B组前后无差异.
结论: 食用白酒及乙醇对胃黏膜均可产生抗损伤作用; 同时胃黏膜PGE2水平增高、TGF-α表达增强, PGE2, TGF-α在胃黏膜适应性保护过程中起到重要作用.
引文著录: 秦咏梅, 周力, 孙屹峰, 张永宏, 侯玉龙, 张国林. 食用白酒灌胃后大鼠胃黏膜的抗损伤作用. 世界华人消化杂志 2007; 15(1): 29-33
Revised: October 20, 2006
Accepted: October 25, 2006
Published online: January 8, 2007
AIM: To observe the response to edible alcohol-induced injury and expression of prostaglandin E2 (PGE2), transforming growth factor-α (TGF-α) in gastric mucosa of rats.
METHODS: A total of 36 Sprague Dawley rats were divided group A, B, and C, intragastrically treated with edible alcohol (530 ± 20 mL/L), ethanol (530 mL/L), and normal saline at 5 mL/kg once every other day, respectively. The rats were killed at 1 week and 1 month after treatment, and the extent of mucosal injury was evaluated. Immunohistochemistry was used to examine the mucosal expression of TGF-α protein. Anther 36 rats were selected and treated as the method mentioned above, and the level of PGE2 in gastric mucosa was determined by enzyme linked immunosorbent assay.
RESULTS: The most severe gastric mucosal injury was found in group C, then in group B, and the rats in group A were found with the mildest mucosal injury. The scores for mucosal injury were significantly different among group A, B and C 1 week (26.5 ± 6.4 vs 40.5 ± 8.1 vs 69.3 ± 4.3, all P < 0.05) and 1 month (34.8 ± 8.0 vs 54.8 ± 8.0 vs 74.8 ± 3.1, P < 0.05) after treatment. The level of mucosal PGE2 was increased significantly in group A and B as compared with that in group C 1 wk after treatment (15.7 ± 1.4, 14.6 ± 1.9 ng/L vs 18.5 ± 2.7 ng/L, P < 0.05), but there was no difference between group A and B. One month after treatment, the level of PGE2 was decreased in group A, not different from that in group C, but there was obvious difference between the former two groups and group B (15.7 ± 1.4, 14.6 ± 1.9 ng/L vs 18.5 ± 2.7 ng/L, P < 0.05). The expression of TGF-α was significantly lower in group A and B than that in group C 1 week after treatment (both P = 0), but no difference was found between group A and B. TGF-α expression was significantly different among group A, B, and C 1 month after treatment (P = 0.013, 0.001, and 0, respectively). The level of PGE2 and the expression of TGF-α were notably different between 1 week and 1 month in group A and C, but not in group B.
CONCLUSION: Appropriate stimulus with edible alcohol and ethanol may lead to adaptive cytoprotection in gastric mucosa through up-regulation of PGE2 and TGF-α.
- Citation: Qin YM, Zhou L, Sun YF, Zhang YH, Hou YL, Zhang GL. Adaptive cytoprotection of gastric mucosa in rats after intragastric administration of edible alcohol. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007; 15(1): 29-33
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v15/i1/29.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v15.i1.29
目前认为胃黏膜保护是指黏膜能耐受经常接触的各种损伤因子, 而结构与功能不受明显伤害的现象[1]. 受到刺激的胃黏膜可启动某些内在的防御机制, 增强其对各种损害因素作用的抵抗力, 即产生适应性细胞保护作用. 有些学者认为慢性饮酒能增强黏膜防御机制[2]. 本研究旨在观察大鼠胃饲食用白酒、乙醇后对无水乙醇胃损伤的适应性保护情况, 黏膜保护因子-前列腺素E2(PGE2)、转化生长因子α(transforminggrowthfactor, TGF-α)的表达情况及其在此过程中的作用.
9周龄健康♂SD系大鼠36只(购于河南医科大学实验动物中心), 体质量为220-280 g, 经1 wk的喂养适应期后, 开始进行实验. 食用白酒530±20 mL/L(贵州茅台); 无水乙醇(分析醇); PGE2酶免疫测定试剂盒(美国BPB生物制品公司); TGF-α免疫组化染色试剂盒及DAB试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司); 酶联免疫检测仪(博赛Biocell-02, 奥地利); IDA-2000高清晰度数码显微图像分析系统(中国科学院空海科技发展有限公司).
36只大鼠随机分为3组, 对照组12只, 给予生理盐水, 实验组A 12只, 给予茅台530±20 mL/L, 实验组B 12只, 给予乙醇530 mL/L, 实验前禁食12 h, 自由饮水, 活动不受限. 按5 mL/kg剂量, 隔日1次直接空腹灌胃, 灌胃量及方法参见文献[3-5], 但略有改动. 于7 d末、30 d末分2批全部处死动物, 处死前2 h空腹胃内灌入无水乙醇2 mL.
1.2.1 胃黏膜损伤测定: 大鼠处死后, 取出胃体, 沿胃大弯剪开, 40 g/L多聚甲醛冲洗后, 将全胃浸入40 g/L多聚甲醛溶液中固定30 min, 平展在平板上, 肉眼观察胃黏膜改变, 用直尺及放大镜测定病变大小并按Guth积分标准计算[6]损伤指数(UI). 制成切片, 进行苏木精-伊红染色观察组织病理学改变.
1.2.2 免疫组化ABC法检测TGF-α: 实验方法参见文献[7]. 以细胞质中有棕黄色颗粒的细胞为阳性细胞. 每张切片随机选择8个视野胃黏膜在高倍镜下进行观察. 应用IDA-2000显微图像分析系统(新乡医学院生命科学院形态学教研室提供), 对选取视野内免疫组化阳性信号, 进行平均灰度分析, 计算模型组与对照组胃组织TGF-α灰度积分值(灰度积分值与染色面积和强度成反比, 表达越强灰度积分值越低).
1.2.3 酶联免疫吸附测试胃黏膜PGE2: 另取36只大鼠, 分成A, B, C 3组, 灌胃剂量及处置方法同前. 胃黏膜中抽取PGE2方法参见文献[8-9]. 按PGE2 EIASA试剂盒说明测定, 测得A值, 据标准曲线求得其含量, 胃黏膜中PGE2含量表示为ng/L.
统计学处理 采用SPSS 12.0分析软件包进行统计学分析, 所有数据用mean±SD表示, 组间比较采用q检验, 组内比较采用t检验. P<0.05有统计学意义.
对照组(盐水组)1 wk大鼠肉眼可见胃黏膜不完整, 广泛线状、片状糜烂及出血, 黏膜表面明显水肿. 1 mo可见较多点片状黑色烧灼样改变. 光镜下可见损伤侵入黏膜全层, 大量上皮细胞脱落, 腺体结构破坏, 中性粒细胞全层浸润; 1 mo组部分病变深度超过黏膜肌层, 形成浅溃疡. 实验组A(白酒组)全胃黏膜较完整, 点片状糜烂、出血和水肿. 1 mo可见散在黑色烧灼点样变. 光镜下损伤局限于黏膜表层, 较多上皮细胞脱落, 固有层可见较多的中性粒细胞浸润(图1). 实验组B(乙醇组)胃黏膜欠完整, 较多点、片状糜烂, 黏膜表面水肿, 可见片状黑色烧灼样改变. 光镜下部分上皮细胞脱落, 部分主细胞、壁细胞肿胀, 腺体结构大部完整, 部分被破坏, 固有层可见较多的中性粒细胞浸润, 一些淋巴细胞及嗜酸性粒细胞.
生理盐水组TGF-α在胃腺颈部、基底部细胞都有表达, 呈弱阳性(图2); 在白酒组、乙醇组胃腺颈部、基底部强阳性表达细胞多见, 图像半定量分析见表1.
| 分组 | 1 wk | 1 mo | ||||
| UI | TGF-α | PGE2 (ng/L) | UI | TGF-α | PGE2 (ng/L) | |
| 茅台A | 26.5±6.4 | 83.7±2.7 | 17.2±1.8 | 34.8±8.0 | 89.5±5.0 | 15.7±1.4 |
| 乙醇B | 40.5±8.1 | 85.4±3.6 | 16.6±1.1 | 54.8±8.0 | 82.3±2.7 | 18.5±2.7 |
| N-S C | 69.3±4.3 | 94.5±2.1 | 13.0±1.5 | 74.8±3.1 | 99.5±5.0 | 14.6±1.9 |
灌胃1 wk后处死大鼠各组胃黏膜UI积分比较: A组与B组、A组与C组、B组与C组差异有统计学意义, P值分别为0.002, 0, 0. TGF-α比较: A组与C组、B组与C组差异有统计学意义, P值均为0; A组与B组无统计学差异, P值为0.304. PGE2比较: A组与C组、B组与C组差异有统计学意义, P值分别为0, 0.001; A组与B组无统计学差异, P值为0.477. 灌胃1 mo后处死大鼠, 各组胃黏膜UI积分比较: A组与B组、B组与C组、A组与C组差异有统计学意义, P值均为0. TGF-α比较: A组与B组、A组与C组、B组与C组差异有统计学意义, P值分别为0.013, 0.001, 0. PGE2比较: A组与B组、B组与C组差异有统计学意义, P值分别为0.005, 0.034; A组与C组无统计学差异, P值为0.366. TGF-α组内1 wk与1 mo比较: A组的P值为0.033, B组的P值为0.117, C组的P值为0.049. PGE2组内1 wk与1 mo比较: A组的P值为0.032, B组的P值为0.144, C组的P值为0.009.
既往研究证实, 弱刺激作用于胃黏膜后, 常导致内源性PGs, TGF-α, NO及三叶肽合成增加, 并通过刺激感觉传入神经, 增加黏膜血流量及黏膜细胞的增殖及移行能力; 重复强刺激作用于胃黏膜则增强黏膜EGF, TGF-α及EGFR表达, 使黏膜的增殖、修复能力明显增加, 加强抗损伤能力. 前者称为适应性保护, 后者称为耐受性保护. 本实验中, A, B组预先给予530 mL/L食用白酒、乙醇刺激胃黏膜, 1 wk后再用无水乙醇强刺激, 与对照组相比, 实验组黏膜损伤程度明显减轻, 3组之间Guth积分均有差异(P<0.01), 其中食用白酒组病变最轻. 前人研究发现, 在一定范围内, 随弱刺激强度的增加, 其屏障破坏程度即增大, 适应性细胞保护作用效应增强, 但往往有一最佳弱刺激强度, 引发的适应性保护作用最大. 推测同等浓度的食用白酒刺激强度优于乙醇, 530 mL/L乙醇刺激强度超出该范围, 保护作用减弱. 本实验中, 胃饲1 mo后, 进行抗损伤实验, 保护作用仍存在, 实验组与对照组相比损伤积分差异显著(P<0.01). 总之, 不管是1 wk或是1 mo, 实验组胃黏膜大部完整, 腺体结构基本不被破坏, 食用白酒、乙醇刺激后均可产生抗损伤作用.
Robert曾做一系列实验, 先给大鼠胃饲200 mL/L乙醇、0.075 mol/L NaOH、0.35 mol/L HCl、40-50 g/L NaCl、5 mmol/L牛黄酸盐等物质后, 可以明显减轻随后给予的致坏死物质(强刺激), 如无水乙醇、0.2 mol/L NaOH、0.6 mol/L HCl、200 g/L NaCl、80 mmol/L牛黄酸盐等所致的胃黏膜损伤[10].
许多学者对胃黏膜适应性保护发生机制进行了探讨. Robert认为弱刺激增加了内源性PGs合成; Uehigashi et al[11]采用细胞淘洗技术、梯度离心方法证实50 mL/L乙醇可刺激胃黏膜内肥大细胞合成PGs, 与适应性细胞保护有关. 吴作艳 et al[12]研究发现, 乙醇连续刺激大鼠胃黏膜, 使PGE含量增加, 起到适应性细胞保护作用, 而胃黏膜损伤是PGE, NO, ET作用失衡的结果. 刘春英 et al[13]在内毒素诱发的幼鼠急性胃黏膜损伤过程中发现, 增加胃黏膜PGE2浓度后, 胃黏膜损伤减轻. 本实验中PGE2值变化复杂, 1 wk内530 mL/L白酒与乙醇可同等程度引起PGE2增加; 1 mo处死, 食用白酒组该值不再增高, 反而略有下降, 与盐水组无差异(P>0.05), 与乙醇组有差异(P<0.01). 对于盐水组, 1 mo与1 wk相比, PGE2值增高显著(P<0.01), 考虑1 mo组处死前灌入无水乙醇后, 黏膜损伤很重, PGE2值2-3 h内迅速增高. 乙醇组前后无差异(P>0.05). 由此得出预先刺激黏膜后, PGE2值增高, 再给予强刺激后, 黏膜损伤明显减轻, 实验组PGE2值高, 进一步说明其在适应性保护中起重要作用. 随时间延长, 乙醇组黏膜损伤较重者, 该值相应较高或增高, 仍具有抗损伤作用. PGE2是由花生四烯酸在环氧合酶作用下合成. 炎症部位该因子合成以COX-2诱导为主, 而COX-2与胃癌的形成关系密切. 黏膜保护是一多因素、多水平、多环节的综合过程, 大鼠胃黏膜在白酒长期、慢性刺激下, 是否产生其他因子抑制PGE2产生, 或可能所选用的白酒在自然发酵过程中产生一些复杂的化合物质, 抑制了COX-2的活性, 使PGE2合成减少, 这些机制有待于进一步研究.
TGF-α在正常的胃黏膜表层细胞, 腺颈部细胞及基底部细胞均有表达, 通过自分泌、旁分泌或内分泌发挥作用. TGF-α参与内皮结构重建, 促进上皮细胞增殖及黏液生成, 增加胃黏膜微循环, 在受损胃黏膜修复及维持完整性中起重要作用. 本实验中, 实验组A, B胃腺颈部、基底部强阳性表达细胞多见, 对照组多为弱阳性表达细胞. 图像半定量分析差异有统计学意义. 实验组该因子表达增强, 胃饲1 wk食用白酒组与乙醇组之间无差异(P>0.05), 1 mo后两组之间出现差异(P<0.05), 乙醇组表达较强. 说明530 mL/L乙醇刺激强度较大, 反复作用后, 黏膜损伤较重, 该因子的高表达使黏膜的增殖及修复能力明显增加, 表现为耐受性保护. Tarnawski et al[14]实验发现, 大鼠胃饲500 mL/L乙醇连续4 d, 组织学检查小凹区、胃腺颈区高度明显增加, 黏膜及胃壁厚度增加, 免疫组化染色黏膜EGF, TGF-α, EGFR表达明显增加, 胃黏膜产生耐受性. 胡义亭 et al[15]临床研究发现, 消化性溃疡活动期患者血清、胃液中TGF-α水平显著低于正常对照组, 认为TGF-α合成与释放减少, 削弱黏膜的防御能力, 促进溃疡的发生, 而在溃疡愈合期, 该值明显增加, 提示TGF-α促进溃疡愈合. 李点玲 et al[16]临床研究发现H pylori+胃溃疡患者胃黏膜TGF-α值高于H pylori-胃溃疡患者, 认为H pylori感染引起胃黏膜炎症反应, 诱导TGF-α等肽类生长因子表达, 参与炎症愈合过程并促进黏膜再生修复.
有学者认为, 弱刺激造成表浅上皮细胞损伤后, 可以在损伤部位形成一碱性保护层--黏液盖, 可以减轻随后给予的腔内强刺激的刺激作用, 起到一种物理屏障作用, 并增强了黏膜修复能力及表浅上皮的快速整复过程. 有研究发现200 mL/L乙醇、50 g/L NaCl可增加黏附黏液层厚度, 并可减轻无水乙醇对黏液层的破坏作用[17].
胃黏膜适应性保护是一个抗损伤和修复的过程, 多种物质均参与其中. 王玮 et al[18]将这些因素概括为: 抗微生物肽、细胞因子、生长因子、Ghrelin以及短链脂肪酸和谷胺酰胺等营养物质. 食用白酒鼻饲后黏膜能够对抗无水乙醇的损伤, PGE2, TGF-α参与黏膜的适应性保护过程, 同时与CGRP介导GMBF的增加. 黏膜防御机制进一步增强. 但经此处理后黏膜能否降低胃H pylori的感染率, 或对其产生适应性, 有待于进一步研究.
胃黏膜保护机制是胃肠基础研究的热点之一. 食用白酒参与对胃黏膜的刺激损伤. 然而适量饮酒, 绝大多数人胃黏膜仍能保持正常的形态、结构与功能, 即使发生损伤也可不同程度的自行修复.
胃黏膜保护作用由多种因素介导, 这些因素相互作用, 形成复杂的网络体系. 前列腺素E2(PGE2), 转化生长因子α(TGF-α)等参与黏膜损伤后的修复过程.
本文将乙醇和食用白酒对胃黏膜的损伤从形态学、组织学及细胞因子的影响等多方位、多层次进行比对研究. 为研究食用白酒对胃黏膜的影响提供实验数据, 对胃黏膜自身防御机制提供直接证据.
胃黏膜保护: 指黏膜能耐受经常接触的各种损伤因子, 而结构与功能不受明显伤害的现象. 分为适应性保护与耐受性保护.
本文研究结果对大鼠胃黏膜保护和抗损伤提供了有意义的实验数据, 有利于该领域的深入研究和发展, 也为进一步在人体验证提供了初步资料. 文章立题依据充分、创新性强.
电编: 张敏 编辑: 张焕兰
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