目的: 应用2-乙酰氨基芴(2-acetaminofluorene, 2-AAF), 研究L02细胞移植到具有正常免疫性的大鼠肝内的存活与增殖情况.

方法: SD大鼠出生前宫内ip正常人L02肝细胞, 诱导胎鼠对L02肝细胞产生免疫耐受, 出生2 wk时分别ip小(1.2 mg/kg)、中(13 mg/kg)、大剂量(30 mg/kg)2-乙酰氨基芴或生理盐水, 隔日行2/3肝切除术, 同时经脾移植DiI染色后的人L02肝细胞, 建立2-AAF/PH肝细胞增殖模型. 采用免疫荧光、RT-PCR、免疫组化、DiI荧光示踪等方法, 在不同时相分别检测人白蛋白、人白蛋白mRNA、增殖细胞核抗原(PCNA)以及在荧光显微镜下观察人L02肝细胞在鼠肝内的分布, 并采用计算机图像分析系统分析不同时相PCNA阳性细胞的数密度和面积密度.

结果: 2-乙酰氨基芴实验组(小、中、大剂量)的各项检测, 均与对照组无明显区别; 于移植后1, 2, 4, 6, 8, 10 wk在荧光显微镜下观察到人L02肝细胞在鼠肝内的动态分布; 移植后2, 4, 6, 8 wk大鼠均检测出人白蛋白及人白蛋白mRNA; 移植后2, 4, 6 wk检测出特异性人增殖细胞核抗原PCNA, 移植后1, 2, 4, 6, 8 wk检测出非特异性PCNA.

结论: 2-AAF/PH模型中, 2-乙酰氨基芴对移植L02细胞无明显增殖作用; L02细胞在2-乙酰氨基芴处理人鼠嵌合肝动物模型中存活10 wk, 产生白蛋白功能持续8 wk.

AIM: To investigate whether human L02 hepatocytes can repopulate after implantation to the normal, immunocompetent rats treated with 2-acetaminofluorene.

METHODS: Human L02 hepatocytes were injected into the peritoneal cavities of fetal Sprague Dawley rats to induce immune tolerance. The 2-week rats were injected with different doses of 2-acetaminofluorene or normal saline, and received partial hepatoectomy. After 1, 1′-Dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) staining, the hepatocytes were implanted to the 3-week rats via the spleen. Immuno-fluorescent staining, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), S-P immunohistochemistry, and DiI staining were used to detect human albumin, human albumin mRNA and specific proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in the rat liver. The distribution of human L02 hepatocytes was observed under fluorescent microscope. The number and area density of PCNA-positive cells were quantified with the help of computer-assisted imgine analyzer.

RESULTS: All the examined indicators were not significantly different between the rats treated with 2-acetaminofluorene and normal saline. Dynamic distribution of human L02 hepatocytes in the rat livers was observed from wk 1 to 10 after implantation. Human albumin and human albumin mRNA were detected from wk 2 to 8 after implantation and the peak content appeared at the 4^th wk. Specific human PCNA was detected in the rat livers from wk 2 to 6 after implantation. There were the most PCNA-positive cells at the 4^th wk. Nonspecific PCNA was detected in the rat livers from wk 1 to 8 after implantation.

CONCLUSION: Human L02 hepatocytes can not significantly repopulate after implantation to the normal, immunocompetent rats treated with 2-acetaminofluorene. Human L02 hepatocytes can survive for 10 wk after implantation, and exhibit unique hepatic biochemical functions for 8 wk.

移植细胞在受体肝内的增殖是其存活及发挥功能的关键, 必须提高移植细胞的增殖能力, 才能建立稳定持久的人鼠嵌合肝动物模型[1]. 研究认为, 移植细胞要大量增殖, 必须满足2个条件: 移植肝细胞有更强的生长优势; 受体细胞的更新必须超过正常肝细胞更新水平, 二者相辅相存的[2]. 前者常用肝脏毒性药物: 倒千里光碱等生物碱、2-乙酰氨基芴(2-AAF)、dipin、呋喃(furan)、丝裂霉素、DDC (3'5-diethoxycarbonyl-1, 4-dihydrocollidine)、烯丙醇、甲基亚硝基氨(DEN)等[3-6], 可阻断受体肝细胞进入再生周期; 后者常采用四氯化碳、2/3肝切除(partial hepatoectomy, PH)等[7-8]再生刺激作用, 二者共同促进移植肝细胞增殖.

2-AAF与PH联合, 即卵圆细胞活化的基本模型[9], 目前国内外多用2-AAF抑制肝细胞的增殖, 在肝细胞再生需求下, 促进卵圆细胞的活化, 但是否能促进人鼠嵌合肝中移植细胞的增殖却少有报道. 我们将诱导免疫耐受的大鼠首先ip 2-AAF, 2 wk后行PH, 同时经脾移植DiI染色后的L02细胞, 建立2-AAF/PH肝细胞增殖模型; 采用免疫荧光、RT-PCR、免疫组化、DiI荧光示踪以及计算机图像分析系统等方法, 检测嵌合于具有正常免疫活性大鼠肝内人L02细胞的存活、增殖情况.

由于实验鼠太小, 无法活体取肝组织且不易继续喂养, 故在实验鼠出生2 wk时经脾移植L02细胞. 实验组1只大鼠因麻醉过量死亡; 对照组2只大鼠因麻醉过量死亡. 从未纳入实验和对照组的胎鼠中选取, 继续给药实验. 其余大鼠营养及生长状况良好.

2.1 DiI荧光示踪

DiI染色的阳性细胞在绿色滤光片下显示红色荧光. 细胞均匀着色呈圆形或椭圆形, 不能区分胞核与胞质. 3种剂量实验组和对照组未见明显区别. 实验组或对照组的4只实验大鼠1, 2, 4, 6, 8 wk均可检测出, 10 wk每组有2至3只大鼠仍可见较微弱的荧光细胞, 其他1至2只为阴性, 每组4只大鼠12 wk均未再检出. 早期时相L02细胞分布在受体鼠肝内的门静脉区域, 聚集成团分布, 以后逐渐扩散到肝实质区域. 荧光细胞数目逐渐减少, 亮度逐渐减弱, 维持10 wk左右, 最后留下细胞核呈现点状荧光, 逐渐消失. 移植后1 wk的DiI荧光显示: 荧光染色区域较多, 有的区域密集分布, 荧光亮度大, 提示移植的L02肝细胞较多, 说明刚从脾转移到肝的L02细胞尚未弥散; 有的区域散在分布, 提示移植的L02肝细胞相对较少. 移植后2 wk和4 wk的DiI荧光显示: 荧光染色区域较多, 未见密集分布, 可见荧光散在分布, 说明从脾转移到肝的L02细胞已逐渐弥散分布. 移植后8 wk的DiI荧光显示: 荧光细胞较少, 可见少量荧光点状分布, 荧光亮度明显减弱(图1).

图1 DiI染色L02细胞荧光图像(×200). A, B, C: 实验组移植1, 4, 8 wk; D, E, F: 移植1, 4, 8 wk.

2.2 鼠肝组织中人白蛋白

FITC标记荧光二抗, 阳性细胞在蓝色滤光片下显示为绿色荧光, 与周围大鼠肝细胞界限清楚, 胞核未着色. 3种剂量实验组和对照组未见明显区别. 移植L02细胞后2 wk的大鼠肝组织中即能检测到合成人白蛋白的L02细胞; 实验组的4只实验大鼠2, 4, 6 wk均可检测出合成人白蛋白的L02细胞, 以4 wk发现绿色荧光细胞最多; 8 wk有3只大鼠可见绿色荧光细胞, 1只为阴性, 4只大鼠10 wk均未再检出(图2).

图2 鼠肝组织中胞质呈绿色的L02细胞的免疫荧光(×400). A: 正常鼠肝组织; B: 实验组移植4 wk鼠肝组织; C: 对照组移植4 wk鼠肝组织.

2.3 PCNA

实验组和对照组各取两份切片, 分组为: 实验组1: 一抗为特异性人PCNA mAb. 特异性人PCNA阳性的细胞核, DAB显色后均为棕色, 其实验组和对照组无区别. 移植L02细胞后1 wk的大鼠肝组织中未能检测到特异性人PCNA; 2 wk才能检测到特异性人PCNA; 每组4只实验大鼠2, 4, 6 wk均可连续检测出特异性人PCNA, 以4 wk发现PCNA阳性细胞最多, 4只大鼠8 wk均未再检出. 实验组2: 一抗为非特异性PCNA mAb. 非特异性PCNA阳性的细胞核, DAB显色后亦为棕色, 其实验组和对照组亦无区别. 移植L02细胞后1 wk的大鼠肝组织中即能检测到特异性人PCNA; 每组4只实验大鼠1, 2, 4, 6, 8 wk均可连续检测出大量非特异性人PCNA(图3). PCNA的细胞图像分析, 实验组1与对照组1比较无统计学差异(P>0.05), 实验组2与对照组2比较无统计学差异(P>0.05, 表1).

	分组	1 wk	2 wk	4 wk	6 wk	8 wk
数密度(10-4个/μm2)	实验组1		0.14±0.03	0.43±0.04	0.26±0.08
	对照组1		0.12±0.06	0.52±0.07	0.11±0.03
	实验组2	6.26±1.07	5.79±0.75	6.32±0.84	7.58±1.17	5.18±1.03
	对照组2	5.17±1.05	7.42±1.22	5.86±1.12	4.46±1.03	6.33±0.75
面积密度(10-4 μm2/μm2)	实验组1		1.58±0.27	2.36±0.26	1.17±0.22
	对照组1		1.38±0.47	2.25±0.33	1.74±0.46
	实验组2	54.6±2.56	49.9±3.37	52.7±4.46	47.5±3.58	51.4±3.27
	对照组2	52.6±1.73	67.2±2.34	62.8±1.83	55.2±1.47	68.3±1.73

图3 肝组织中胞核PCNA呈棕色的L02细胞(SP×200). A: 正常鼠肝; B: 非特异性PCNA作一抗; C: 实验组; D: 对照组.

2.4 RT-PCR检测人白蛋白mRNA

实验组和对照组均于移植后2, 4, 6, 8 wk检测出人白蛋白mRNA. 分别采用人和大鼠白蛋白mRNA引物作RT-PCR时, 可在实验大鼠肝组织中检测到相应的人白蛋白mRNA条带(241 bp)及大鼠白蛋白mRNA条带(388 bp)(图4).

图4 RT-PCR检测肝组织人白蛋白和鼠白蛋白mRNA. 1: 标准分子质量DNA Marker; 2, 3: 正常大鼠肝; 4, 5: 人肝; 6, 7: 嵌合鼠肝; 2, 4, 6: 大鼠白蛋白mRNA引物, 2对照组大鼠及6实验大鼠肝组织中均出现鼠白蛋白mRNA, 扩增目的片段388 bp; 而4为人肝组织未出现相应扩增产物; 3, 5, 7: 人白蛋白mRNA引物, 3对照组大鼠肝组织未出现扩增产物, 5为人肝组织和7为实验大鼠肝组织均出现人白蛋白mRNA, 扩增目的片段241 bp.

肝细胞脾内植入后, 50%-65%随门脉血流迁移到受体肝窦, 但其中大约70%被门静脉血内的巨噬细胞清除, 残留的移植肝细胞在穿过肝窦内皮层时失去其细胞膜缝隙连接, 这些细胞合成血管内皮生长因子及获得细胞膜再生[12], 在移植5 d后可观察到移植的肝细胞与宿主肝细胞间的缝隙连接及胆管样结构的重构, 意味着移植细胞成功整合需要5 d以上[13-14]. 移植肝细胞与宿主肝整合后, 才可表达出白蛋白、胆汁的代谢和酶等功能. 我们在1 wk未能测出人白蛋白及特异性人PCNA, 而荧光示踪可见阳性, 提示移植L02细胞虽已转移并整合至鼠肝内, 但尚未具备合成白蛋白和增殖的功能. 肝细胞的主要功能之一是合成白蛋白, 所以白蛋白的合成是判断肝细胞功能非常敏感的指标, 其含量与有功能的肝细胞数量成正比. 许多研究将其作为衡量成熟肝细胞数量的指标[15]. 我们采用免疫荧光技术和RT-PCR, 从移植后2, 4, 6, 8 wk嵌合肝大鼠肝组织中检测出人白蛋白和人白蛋白mRNA, 证明L02细胞不仅在大鼠肝组织中存活, 而且具有正常人肝细胞一定的生物学功能. 既往研究表明, 肝细胞移植后的免疫排斥反应一般发生在移植后3 wk[16], 我们的实验发现L02细胞移植后8 wk仍具有合成白蛋白的功能. 因此, 本实验在诱导免疫耐受基础上进行的人肝细胞异种移植, 移植细胞的消亡不是因为与宿主的免疫排斥反应, 而是移植细胞有限的增殖能力[17]. 但实验同时发现, 2-AAF实验组(小、中、大剂量)均与对照组无显著区别, 证明2-AAF对移植L02细胞无明显增殖作用.

亲脂性碳花青荧光染料DiI标记整个细胞[18], 对活体细胞无毒性, 不会影响细胞活性和基本生理特性, 不从已标记的细胞转移到未标记的细胞, 且荧光衰减慢[19]. 有报道标记的神经元在体外保持4 wk以上, 而体内保持活性9 mo以上, 仍没有明显衰减和向周围的神经元细胞转移[20]. 运用DiI对SD大鼠进行脾内肝细胞移植示踪观察, 发现经DiI标记的肝细胞容易从宿主组织中辨认出来, 荧光L02细胞移植到鼠肝后, 数目逐渐减少, 亮度逐渐减弱, 不同时相的DiI及免疫组化均显示了L02细胞的分布: 移植的L02细胞首先到达受体鼠肝内的远端门静脉区域和肝窦, 聚集成团分布, 以后逐渐扩散到肝实质区域, 并呈散在分布[21]. 3种剂量实验组和对照组结果未见明显区别. 移植10 wk的荧光点基本消失, 可能是残余移植细胞活性下降, 也可能意味着细胞死亡或其碎片为吞噬细胞吞噬. 该荧光剂显示时间较长, 较好显示了L02细胞整合后的存活情况. 同时, 通过免疫组化和免疫荧光发现, 植入肝细胞还表达了合成白蛋白及增殖功能.

我们应用的肝毒性药物2-AAF是一种致癌药物, 他在肝细胞内可被Ⅰ相代谢酶分解为具有肝细胞毒性的N-羟基衍生物, 该物质为细胞有丝分裂的抑制剂, 可有效抑制肝实质细胞的增殖. 胆管上皮细胞及幼稚的肝卵圆细胞内富含Ⅱ相酶, 可将肝细胞致癌剂解毒, Ⅰ相酶的含量则极低, 故2-AAF不能抑制此类细胞的增殖. 此时给予PH, 在肝细胞再生需求下, 由于2-AAF抑制了肝细胞的增殖, 促进胆管上皮细胞向卵圆细胞大量增殖[22]. 70% PH是最常见的大鼠肝再生模型, 肝严重损伤后的再生主要是肝前体细胞即卵圆细胞或小肝细胞的增殖与分化的过程, 可能少量的成熟肝细胞通过大量增殖来参与肝脏的再生与修复[23]. 2-AAF是常用于卵圆细胞活化的肝毒性药物, 阻断受体肝细胞的DNA合成, 从而抑制肝细胞的增殖[24-25], 在肝细胞再生需求下, 可促进卵圆细胞的活化, 但是否能促进移植细胞在嵌合肝中的增殖却少有报道. 计算机图像分析和统计学分析, 检测不同时相PCNA细胞的数密度和面积密度. PCNA在静止期细胞中量很少, G1晚期开始增加, S期达到高峰[26]. 可作为评价移植肝细胞增殖状态的指标[27]. 我们从移植后2, 4, 6 wk大鼠肝组织中检出细胞核为棕色的特异性人PCNA阳性细胞, 表明此期间嵌合鼠体内有处于增殖期的人肝细胞存在. 特异性人PCNA作一抗时, 实验组与对照组在时间和数量上均无明显差异, 说明2-AAF虽能抑制受体肝细胞增殖, 促进卵圆细胞的增殖分化, 但未能促进移植肝细胞的增殖; 4 wk PCNA细胞数量最多, 提示移植肝细胞在4 wk时增殖能力最高; 8 wk PCNA细胞基本消失, 即L02细胞增殖能力消失, 但荧光与组化显示, 仍存在活的移植细胞并具备一定的功能. 非特异性PCNA作一抗时, 实验组与对照组也无明显差异, 自1 wk出现阳性胞核后, 不同时相检测一直持续存在且数量很多, 说明鼠肝细胞在行PH后迅速表现出强烈的增殖趋势, 对照组受体肝细胞及移植肝细胞均开始增殖, 由于此类模型可能以卵圆细胞增殖为主, 且移植肝细胞数量远远少于受体肝细胞, 所以, PH促进L02细胞的增殖能力非常有限[28]; 实验组由于2-AAF广泛破坏受体肝细胞的DNA合成, 使受体肝细胞增殖受阻, 而此类模型可能以卵圆细胞增殖为主, 即使阻断了受体成年肝细胞增殖, L02细胞的增殖比例仍然很小. 由于移植肝细胞数量在嵌合肝中比例很小, PH促进L02细胞增殖的数量很少, 所以, 非特异性PCNA在1 wk出现, 而特异性人PCNA在1 wk未能发现, 且在相应时相, 特异性人PCNA与非特异性PCNA比较数量明显稀少.

本研究证实, L02细胞宫内诱导胎鼠产生免疫耐受, 出生后移植到实验鼠肝内, 可成功建立针对移植物耐受的动物模型, 移植的L02细胞可以在嵌合鼠体内整合、增殖, 并具有一定的生物学功能; 但是, 2-AAF不能促进移植肝细胞的增殖, L02细胞在正常免疫活性的大鼠肝内存活未超过10 wk. 为提高移植肝细胞在宿主肝内的生存时间和比例, 有待进一步应用其他方法促进移植肝细胞的增殖, 从而建立长期有效的动物模型.