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世界华人消化杂志. 2003-06-15; 11(6): 806-809
在线出版日期: 2003-06-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i6.806
HCVC区DNA疫苗的研究现状
孙利, 周永兴
孙利, 周永兴, 中国人民解放军第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心 陕西省西安市 710038
通讯作者: 孙利, 710038, 陕西省西安市, 中国人民解放军第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心.
收稿日期: 2002-10-29
修回日期: 2002-11-10
接受日期: 2002-11-16
在线出版日期: 2003-06-15

1974年Golafield 首先报告输血后非甲非乙型肝炎. 1989年Choc et al 应用分子克隆技术获得本病毒基因克隆, 并命名本病及其病毒为丙型肝炎 (Hepatitis C)和丙型肝炎病毒(HCV).由于至今尚未分离到病毒颗粒, 使得必须以可得到的病毒核酸成分进行重组、表达蛋白, 进而进行疫苗研究.本文详细阐述了HCV C区基因结构、HCV C蛋白功能以及HCV-C区DNA疫苗方面的内容及进展, 以期为将来进一步的研究提供帮助.

关键词: N/A
引文著录: 孙利, 周永兴. HCVC区DNA疫苗的研究现状. 世界华人消化杂志 2003; 11(6): 806-809
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: October 29, 2002
Revised: November 10, 2002
Accepted: November 16, 2002
Published online: June 15, 2003

N/A

Key Words: N/A
0 引言

HCV归为黄病毒科HCV, 是肠道外非甲非乙肝炎的主要致病因子, 呈世界范围性, 其致病常引起持续感染, 并且HCV的慢性感染和慢性肝脏疾病、肝硬化及肝细胞癌(HCC)明显相关[1-7]. 因此, 运用疫苗保护免受HCV感染很有必要.从基因学角度来说, 慢性病毒性肝炎属获得性基因疾病, DNA疫苗能诱导细胞免疫及体液免疫, 从而使其成为免疫治疗的策略之一[1,8]. 相信随着分子生物学技术的发展, 基因治疗将为慢性病毒性肝炎患者带来福音.

1 HCV C区基因结构

HCV病毒体呈球形, 直径<80 nm(在肝细胞中为36-40 nm, 在血液中为36-62 nm), 为单股正链RNA病毒, 在核衣壳外包绕含脂质的囊膜, 囊膜上有剌突. HCV-RNA全长9 600 bp, 含有一个大的单一开放阅读框(ORF), 编码约3010个氨基酸的病毒前体蛋白. 在HCV的编码基因中, 核心区基因位于HCV基因组1-191位氨基酸, 具有高度遗传保守性, C基因表达产物具有良好的抗原稳定性.

2 HCV C蛋白功能

C蛋白经宿主蛋白酶裂解后产生蛋白P23、P21和P16(仅见于HCV-1). C蛋白主要位于胞质的内质网表面, 少数位于胞核内[9], 呈颗粒状, 可在昆虫细胞内形成40-60 nm颗粒, 可能形成病毒衣壳; 可调节几种转录和翻译的细胞基因, 作用于5'UTR的IRES, 从而影响转录起始. C蛋白可通过上调细胞周期蛋白E促进细胞增生, 可能通过基因调节实现致瘤作用. C蛋白促进或抑制细胞对Fas介导的凋亡, 与淋巴毒素-β受体的尾部作用而抑制程序性细胞死亡(PCD). C蛋白是较强的免疫刺激原, 可产生较强的免疫反应, 通过NF-κβ途径影响细胞水肿和免疫反应. HCV核心蛋白的N端含有两个DNA结合区, 结合区序列与核内转移信号的部分重迭以及对结合靶DNA序列的非选择性可能是HCV核心蛋白具有多功能的基础[10].

HCV感染的慢性化和致HCC产生主要是通过病毒基因编码的蛋白与宿主细胞的相互作用实现. HCV核心蛋白具有与DNA结合的基序、核定位信号、磷酸化位点, 可能具有基因调节的功能. 近年来, 有大量的体内外实验揭示HCV核心蛋白能与细胞的多种蛋白结合, 调节多种细胞基因的转录活性, 在HCV感染的病理发生和慢性化以及宿主细胞的恶性转化等过程中起重要作用, 主要表现在影响细胞凋亡和免疫系统的功能, 并参与细胞恶性转化的发生等.

3 DNA疫苗的概述
3.1 DNA疫苗的定义

DNA疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接导入动物体细胞内, 并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白, 诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答, 以达到预防和治疗疾病的目的. DNA疫苗又称为基因疫苗或核酸疫苗, 这种免疫称为DNA介导的免疫、基因免疫、核酸免疫以及遗传免疫等.

3.2 构建

疫苗研究最鼓舞人心的新领域之一是DNA疫苗. 将有关的基因克隆到大肠杆菌的质粒中, 使哺乳动物细胞增加该基因的表达. 将其注入动物体内后, 该质粒进入宿主细胞核, 在核内仍以非整合形式存在, 并按要求合成抗原. 以这种方式产生的抗原优于传统疫苗. 首先, 在细胞内产生的抗原有可能以更为天然的折叠构型而有利于中和抗体的产生. 抗原也可被带到细胞表面, 由淋巴细胞抗原1型分子表达.该质粒载体可能含免疫调节序列, 可刺激细胞免疫.

3.3 组成

DNA疫苗由病毒的保护性抗原基因和载体质粒两部分组成. 目的基因通常是选择该病毒的主要保护性抗原基因, 最好是可对多数毒株都有保护作用的抗原基因. 抗原基因可以是单个基因或具有协同保护功能的一组基因, 也可以是编码抗原决定簇的一段核苷酸序列. 质粒载体必须是能在大肠杆菌中高拷贝地扩增, 而在动物细胞内则能高效表达, 但不复制, 也不含有向宿主细胞基因组内整合的序列. 一般以PBR322或PUC质粒为基本骨架, 带有细菌复制子(ORI), 真核生物的启动子(有的含有增强子)和Poly稟加尾信号. 启动子大多来源于病毒基因组, 如CMV, PSV, LTR等, 其中以CMV的转录活性最高; Poly稟序列具有保证mRNA在体内的稳定性的作用, 这种稳定性因Poly稟来源不同而异, 目前认为较好的Poly稟来自牛生长激素基因或兔B球蛋白基因; 载体中如果含SV40复制起始点, 应该使其缺失.筛选基因可以选用卡那霉素, 氨苄青霉素或新霉素等抗性基因.

3.4 优点

传统用于传染病预防的疫苗有减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗和重组活载体疫苗等, 与这些疫苗相比, DNA疫苗免疫效果好, 对已有免疫力的个体接种仍可起作用, 且免疫应答持久, 很微量的抗原即可刺激机体产生强而持久的免疫应答. DNA疫苗引起CTL应答, 不存在散毒及毒力回升的危险. DNA疫苗易于构建, 且方法简便、价格低廉、用量少, 便于贮藏和运输, 使用也较为方便, 比其他疫苗更经济. DNA疫苗具有相同的理化性质, 为联合免疫提供了可能.

3.5 免疫应答

在开发和研制HCV疫苗的过程中, DNA免疫是在快速构建、评价和筛选免疫原方面的有效办法. DNA疫苗是一种新的征对靶抗原诱导产生免疫的方法. 他直接使识别基因编码的抗原和包含基因片段的抗原成为疫苗传播媒介, 识别侯选基因可快速进入感染机体和肿瘤细胞. DNA一项优点是在免疫的所有路径均显示了活性, 特别是细胞毒T细胞反应, 而在蛋白疫苗中很难产生.对于各种病毒包括那些血液传播的病毒, DNA疫苗均可被用于预防措施中. 对于慢性感染和肿瘤患者, DNA疫苗则可作为一种治疗措施.在这种情况下, 可把具有免疫活性的基因片段引入疫苗中, 对基因片段进行合适处理以及联合增加免疫的操作识别系统[11].

4 HCV C区DNA疫苗的研究进展
4.1 丙肝DNA疫苗定义

丙肝DNA疫苗含有编码病毒蛋白(如核心蛋白、包膜蛋白)的基因, 宿主细胞摄取外源性DNA并表达病毒基因、产生相应的病毒蛋白, 后者通过宿主细胞的主要组织相容性复合体I类(MHC-I)途径刺激CD8+细胞毒性T细胞启动细胞介导的免疫反应, 从而发挥抗病毒作用[12].

4.2 HCV C区DNA疫苗制备

HCV的DNA疫苗制备主要集中在能刺激保护性抗体产生的包膜蛋白以及能诱导细胞毒性T淋巴细胞的核心蛋白或NS 5肽. 将编码核心蛋白(pC)、E1蛋白(pE1)、E2蛋白(pE2)、核心蛋白E1、E2(pCE1E2)、E1和E2蛋白(pE1E2)、E2结构N-端高变区(pE2-HVR)的质粒转染到哺乳类动物细胞以及接种于鼠, 发现6种DNA质粒在细胞内均能表达特异性的抗原, 但有编码核心蛋白的质粒能导致特异性的细胞毒性T淋巴细胞反应. 两种长度的HCV核心基因片段在E.coli中的表达, 从HCV感染者的血清扩增出核心区基因, 利用表达质粒pQE-30, 构建了两种重组质粒, 其插入片段分别为HCV的全长核心区基因(c573)和"截断型"基因(c375). 经IPTG诱导, 含两种质粒的菌株都表达了目的蛋白, c573表达的蛋白分子量为22 kD, 表达量占菌体蛋白的8.7%; c375表达的蛋白分子量为19kD, 表达量占菌体蛋白的39.9 %. 经Ni-NTA金属螯合层析纯化, 获得了高纯度的目的蛋白. 这两种蛋白均可特异地与丙型肝炎患者血清发生反应, 表明具有良好的抗原活性.

4.3 HCV C区DNA疫苗表达

人肝细胞[13]和黑猩猩对HCV很敏感, 但HCV体外培养尚未找到敏感有效的细胞培养系统.有报道HCV核心蛋白在酵母中表达成功[14]; 以非融合蛋白的方式, 在大肠杆菌中高效表达了完整的HCV核心蛋白, 具有较高生物活性[15,16]. Hao et al [17]构建了HCV C基因腺病毒表达载体的骨架质粒, 并证实其可以在7721细胞中瞬时表达HCV C基因. 应用PCR方法获取完整的HCV核心区cDNA片段, 克隆到真核表达载体PBK-CMV上, 可在HepG2中稳定表达C蛋白, 提供了理想的实验用细胞株[18].

4.4免疫应答

HCV核心基因疫苗能诱导Balb/c小鼠产生良好的细胞及体液免疫应答[19-25]. 表达HCV结构蛋白(C, E1, E2)的FVB/n转基因小鼠及野生型(WT)FVB/n小鼠经肌肉注射免疫表达核心(pHCVC)质粒或C/E1/E2(pHCVSt)质粒. WT和转基因小鼠经结构蛋白或包膜蛋白免疫后均可产生抗C抗体和显示T细胞增生反应. WT小鼠免疫pHCVSt后, 只产生抗E2的CTL活性, 非针对抗C或抗E1, 而当WT小鼠免疫pHCVC时可产生强烈的抗C的CTL活性. 经pHCVSt免疫的转基因小鼠未测出抗C或抗包膜蛋白的CTL活性, 但免疫pHCVC的转基因小鼠产生了独特型抗C的CTL活性[26].

4.5 增强策略

Balb/c(H-2d)和C57bl/6小鼠接受联接多顺反子C/E1/E2/NS2/NS3(pRC/C-NS3)的黄痘病毒增强了对HCV蛋白的抗体和细胞反应, CD8(+)T细胞反应增强[27]. 重组体pCD-HCV1、pCD-HCV2和pCD-HCV3均可诱导小鼠产生抗体和脾细胞对HCV抗原增生反应[28-30]; 重组体还可诱导鼠PBMC对HCV抗原的增生反应及使SP2/0-HCV-C细胞成瘤性显著降低; 通过免疫鼠荷瘤检测体内CTL反应, 可观察到免疫组鼠发瘤时间滞后, 发瘤部位减少和存活时间延长. 重组质粒pcDNA HCV-C治疗组, 使SP2/0-HCV-C细胞成瘤性显著降低, 对HCV皮下移植瘤有一定的治疗作用[31]; 与表达IL-12质粒联合接种后, 治疗作用加强[32]. 脂质转染剂[33]或联合注射GM-CSF细胞因子[22]可以促进基因疫苗的摄取并增强其诱导的抗病毒免疫应答的效力. pRSC-HBV/HCV可分别表达HBcAg及HCV核蛋白, 免疫Balb/c小鼠后可诱导其体液免疫应答[34,35]. 双表达载体pcDNA3.0 BA同时输送GM-CSF与pc154基因能增强Balb/c小鼠对HCV C蛋白基因的体液免疫应答及免疫鼠脾淋巴细胞对特异性抗原刺激的增生能力[36]. 重组的HCV结构区DNA疫苗(pBK-CMV)能诱导小鼠体内特异性T淋巴细胞反应[37]. rhIL-12可在体外显著增加慢性HCV感染者淋巴细胞的增生反应[38].

4.6 联合免疫

HCV多表位抗原基因PCX克隆到真核表达载体pREP9(RSV启动子)及 pcDNA3(CMV启动子)中, 构建真核表达载体pREP9/PCX及 pcDNA3/PCX, 将其肌肉注射免疫小鼠及家兔, 可诱发特异性免疫应答且安全性好[39]. HCV口服减毒鼠伤寒沙门菌DNA疫苗可诱发特异性的免疫应答[40]. 为探讨复合多表位丙型肝炎病毒(hepatitis Cvirus, HCV)及恶性疟原虫(plasmodium falciparum, Pf)双价疫苗的可行性, Huang et al[41]将人工合成的复合多表位HCV基因PCX及Pf抗原基因AB(SPf66+SPf105)克隆到谷胱甘肽转硫酶(GlutathioneS-transferase, GST)表达载体pGEX-2T中, 并在大肠杆菌中高效表达GST-HCV-Pf复合抗原(GST-CAB), 发现GST-CAB融合蛋白具有良好的HCV及Pf免疫特异性, 可诱发理想的体液及细胞免疫应答, 可望成为HCV-Pf双价疫苗的候选抗原.免疫多表位的PCX蛋白可以诱导机体产生高水平的免疫应答[42]. HCV不同区段的基因重组抗原或人工合成多肽可诱导HLA-II类分子限制CD4+ T细胞增生, 这种增生反应的强弱可能反映不同人群对HCV免疫应答的不同, 并与HCV感染的预后有关. CSpcDNA3.1融合重组质粒都优于CpcDNA3.1+SpcDNA31联合基因的免疫, 融合DNA疫苗有望成为慢性病毒性肝炎预防和治疗的制剂[43].

4.7 展望

DNA疫苗可产生强大的细胞免疫, 这是灭活的传统疫苗无法产生的. 联合疫苗机制可诱导增强CD8(+)CTL和IgG2a反应, 这会涉及许多病原体疫苗的发展, 包括HCV, 后者需要很强的抗体和CTL反应[44]. 电基因传递(EGT)法将质粒DNA转入到肌纤维中, 是一种提高遗传免疫力的策略. EGT诱导产生的体液反应比传统的裸DNA免疫高10-30倍. EGT提高细胞和体液免疫的能力是抗原非依赖性的, 可望成为将来防治HCV及其他感染性疾病的一种安全低费用的治疗方法[45]. 用复制和非复制核酸疫苗与rSFVs来评估抗HCV疫苗的发展[46]; 描述p214K9表位并结合用流式细胞仪分析CTL反应可以成为定级不同HCV疫苗策略产生原始CTL反应的能力的方法之一[47]. DNA疫苗产生的细胞免疫在保护机体免受结核杆菌、疟原虫、利什曼原虫、HIV等细胞内致病原的侵袭方面起重要作用. 实际上, 这是迄今为止一直在小鼠体内进行的研究[48]. 给20名志愿者肌注3剂恶性疟原虫环孢子蛋白, 其中11名志愿者外周血出现细胞毒T细胞. 这些资料十分鼓舞人心, 但其安全性问题以及是否能产生保护水平的免疫反应需进一步得以验证.

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