Isolierung und Kultur von organotypischen Endothel- und Glattmuskelzellen aus dem embryonalen Ductus arteriosus der Ratte

Einleitung: Der Ductus arteriosus (DA) ist eine pränatal lebenswichtige Gefäßverbindung zwischen Pulmonalarterie und Aorta descsendens. Im Rahmen der postnatalen Adaptation erfolgt zunächst sein funktioneller Verschluss durch Glattmuskelzellkontraktion, gefolgt vom definitiven Verschluss durch Intimaproliferation und Gefäßeinsprossung bis hin zur Obliteration. Um die Rolle verschiedener Angiogenesefaktoren beim Ductusverschluss zu untersuchen, haben wir ein Modell zur Isolierung und Kultivierung von vaskulären Glattmuskelzellen (VSMC) und Endothelzellen (EC) aus embryonalem Ratten-DA-Gewebe entwickelt. Methodik: Nach Tötung terminiert verpaarter trächtiger Wistar-Ratten am Embryonaltag 21 (E21), Entnahme und Makropräparation der Foeten, Mikropräparation der unter 1mm großen Gefäßabschnitte und Überführung in Kulturmedium werden die ECs durch kurzzeitigen enzymatischen Verdau mittels Kollagenase isoliert und kultiviert. Durch Inkubation des übrigen Gewebes mit einem Enzymgemisch (Elastase, DNAse, Kollagenase, Trypsin-Inhibitor) über Nacht und verschiedenen Filtrationsschritten werden VSMCs aus dem Gewebeverband herausgelöst und in Kultur genommen. Die Aufreinigung beider subkonfluenter Zellkulturen erfolgt zum Zeitpunkt der ersten Passage durch immunomagnetische Zellsortierung mittels MACS-Technik, durch die bestimmte Zellen aus heterogenen Zellgemischen mithilfe von Magnetpartikeln, die mit spezifischen Antikörpern behaftetet sind, separiert werden. Einerseits erfolgt die Positivseparation zur Anreicherung von ECs (CD31positiv) in der Endothelzellkultur andererseits die Negativseparation von Fibroblasten (CD90 positiv) und ECs (CD31positiv) in der VSMC-Kultur. Die Reinheit der so gewonnenen Kulturen und die Rate vitaler Zellen wird durchflusszytometrisch kontrolliert und liegt bei 87–95%. Schlussfolgerung: Dieses embryonale Zellkulturmodell ermöglicht es, Fragestellungen zu untersuchen, die ansonsten aufgrund der limitierten Menge an Ausgangsgewebe, einer Untersuchung nicht oder nur in begrenztem Umfang zugänglich sind. Dieses Modell schafft weiterhin die Voraussetzung, Zellkulturen aus Geweben, denen prä- und postnatal eine divergierende Funktion (DA) zukommt, zu isolieren und die an diesem Umstellungsprozess beteiligten Faktoren näher zu untersuchen.