Fluoreszenz-basierte Visualisierung von Leukozyten-Migration in inflammatorische Granulome

Ziele: Die optische Bildgebung ermöglicht mit hoher Sensitivität die Detektion kleinster Mengen von Fluorochromen im Gewebe. Ziel dieser Studie war es daher, die Migration von Fluoreszenz-markierten Makrophagen mittels Reflektionsbildgebung (FRI) sowie Fluoreszenz-basierter Tomographie (FMT) nachzuweisen. Methode: Murine Makrophagen wurden aus dem Knochenmark von Balb/c Mäusen gewonnen. Die Zellen wurden mit dem Fluoreszenzfarbstoff DiR (Ex/Em: 750/780 nm) markiert. Die Vitalität der Zellen sowie ihre Funktionalität (Phagozytoserate, NO-Produktion, Adhärenz, Apoptose) wurden in vitro überprüft.

Bei Nacktmäusen (n=8) wurde durch s.c. Injektion eines LPS-haltigen (Lipopolysacharid-haltigen) Biogelpellets (500µl) in die Flanke ein Entzündungsreiz induziert. Zur Kontrolle wurde kontralateral ein Biogelpellet ohne LPS implantiert.

Jeder Maus wurden 1×107 DiR-gefärbte Makrophagen i.v. injiziert. In den nachfolgenden sieben Tagen wurden die Tiere mittels FRI untersucht und das Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR) für die implantierten Pellets bestimmt. Die räumliche Verteilung und die Quantifizierung von Makrophagenpopulationen in tieferen Gewebeschichten wurden in der FMT evaluiert. Anschließend wurden die Pellets explantiert und die eingewanderten Zellen mittels Duchflusszytometrie (FACS) auf DiR-Färbung und Vitalität (FSC, SSC) hin untersucht sowie Makrophagen -spezifische Oberflächenmarker (F4/80; Mac-1 MCSF-Rezeptor) bestimmt. Ergebnis: Die Markierung der Zellen mit DiR beeinträchtigte deren Vitalität und Funktionalität nicht (Kontrolle vs. DiR-markiert: Phagozytoserate 54% vs. 56%; NO-Produktion nach Stimulation 34,8µMol vs. 35,1µMol Nitrit). Die FRI zeigte eine signifikant stärkere Einwanderung von markierten Zellen in das LPS getränkte Pellet im Vergleich zur Kontrollseite (z.B. Tag3: 550±291 vs. 364±148; p<0.05). Die 3D FMT-Rekonstruktionen bestätigten die FRI Daten und zeigten eine Makrophagenverteilung überwiegend in der Peripherie der Pellets. Die FACS-Analyse nach Extraktion der Pellets konnte sowohl die Migration wie auch die Vitalität der DiR-markierten Makrophagen bestätigen (bis zu 30% markierter Makrophagen in der Zellpopulation auf LPS-Seite). Schlussfolgerung: Die optische Bildgebung ist ein sicheres und sensitives Verfahren zur in-vivo Visualisierung der Migration Fluorochrom-markierter Makrophagen. In Kombination mit tomographischen Messverfahren sollte diese Methode für eine Quantifizierung der zellulären Immunantwort in vivo geeignet sein.

Korrespondierender Autor: Eisenblätter M

Universitätsklinikum Münster, Institut für klinische Radiologie, Sertürnerstraße 7, 48149 Münster

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