Durchflusszytometrische Bestimmung der Phagozytoseaktivität von Monozyten im Vollblut

Hintergrund: Die Fähigkeit zur Phagozytose von Bakterien ist essentieller Bestandteil des neonatalen Immunsystems und möglicherweise als immunologischer Funktionstest geeignet. Die Phagozytosekapazität lässt sich in aufgereinigten Monozyten in einer bisher aufwändigen Prozedur mittels fluoreszierender Bakterien (gfp-markierte Escherichia coli (E. coli) quantifizieren und ermöglicht vergleichende Einbaukinetiken bei verschiedenen Individuen. Hypothese: Die Messung der monozytären Phagozytoseaktivität ist aus Vollblut mit minimalen Volumina und einem erheblich reduzierten Aufwand durchflusszytometrisch möglich. Methodik: 50µl Vollblut gesunder Erwachsener; mit unterschiedlichen Antikoagulantien (Lithiumheparin [100 IE/ml], EDTA [Sarstedt]; Citrat [Sarstedt]) versetzt; wurden mit 1×106 E. coli DH5alpha, welche grün fluoreszierendes Protein exprimieren, für 5–60 Minuten inkubiert. Nach Abzentrifugation freier Bakterien wurden Zellen fixiert, mit anti-CD14-PE gefärbt und Phagozytoseindex (CD14+gfp+: CD14+ Monozyten), bzw. -kapazität (rel. gfp-Fluoreszenzaktivität, MFI von CD14+) durchflusszytometrisch ermittelt. Ergebnisse: In EDTA- und Heparin-Vollblut waren phagozytierende und nicht-phagozytierende Monozyten klar abgrenzbar. Der Phagozytoseindex stieg 15 Minuten nach Bakterienzugabe bei beiden Antikoagulantien auf 54±17% an und blieb bis 60 Minuten konstant bei 60±12%; die Phagozytosekapazität blieb ebenfalls konstant (124±20 MFI). Triplikatmessungen ergaben maximale Abweichungen von 9% innerhalb der Gruppen. In Citratblut zeigte sich keine monozytäre Phagozytoseaktivität, da Monozyten in der Galertschicht absorbiert wurden. Die vergleichende Messung zwischen aufgereinigten mononukleären Zellen und EDTA-Vollblut ergab bei letzterem eine um zirka 50% höhere monozytäre Phagozytosekapazität nach 15 Minuten. Schlussfolgerung: Das Messsystem mit Heparin- oder EDTA-Blut ermöglicht es, Phagozytosekapazität und -index von E. coli durch Monozyten zu ermitteln und könnte sich bei einem Probevolumen von nur 50µl als Funktionstest bei Frühgeborenen eignen.