Charakterisierung heterogener Subpopulationen zirkulierender Tumorzellen mittels Multiplex Real-Time PCR bei Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom

 

Einleitung/Falldarstellung:

Der Nachweis zirkulierender Tumorzellen (CTCs) im Blut ist bei Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom ein unabhängiger Prognosefaktor für das Gesamtüberleben und das progressionsfreie Überleben. Bei CTCs handelt es sich um sehr heterogene Zellpopulationen. Die Detektion und molekulare Charakterisierung einzelner CTCs ist daher von großer Bedeutung um aktuell eingesetzte Therapieschemata zu optimieren und Therapieresistenzen zu vermeiden. Das Ziel dieses Projektes ist die Charakterisierung einzelner CTCs mittels Genexpressionsprofil-Analysen.

Methodik/Material:

30 Gensonden wurden zusammengestellt, die mit epithelialen und mesenchymalen Zelleigenschaften oder endokrinen Therapieresistenzen assoziiert sind. Diese wurden in unterschiedlichen Zellpools als auch auf Einzelzellebene mithilfe der Brustkrebszelllinien MCF-7 (epithelial) und MDA-MB-231 (mesenchymal) getestet. Des Weiteren wurde der Einfluss von Zellfixierung (CellSave®) und Permeabilisierung (Triton X-100) anhand gespikter Brustkrebszellen auf die PCR-Qualität untersucht. Mithilfe des CellCelector™-Mikromanipulators wurden Einzelzellen isoliert und im Anschluss die RNA extrahiert. Nach cDNA-Synthese und Präamplifikation wurden mittels Multiplex Real-Time PCR Genexpressions-Profile erstellt.

Resultate/Ergebnisse:

Spezifische Amplikons können für alle 30 Gentranskripte erzeugt werden. In Titrationsexperimenten lassen sich die PCR-Reaktionen der Referenzgene ACTB, GAPDH und UBC bis auf Einzelzellebene nachweisen. Zunehmende Zellzahlen korrelieren linear mit den detektierten Ct-Werten. Die Behandlung der Zellen mit CellSave®, einer Permeabilisierung oder der Kombination aus beidem beeinträchtigt die PCR-Ergebnisse nicht signifikant im Vergleich zu nativen Zellen. Die Genexpressionsprofile einzelner nativer MDA-MB-231 und MCF-7 Zellen zeigen signifikante Unterschiede hinsichtlich epithelialer, mesenchymaler und endokriner Transkripte.

Schlussfolgerung/Zusammenfassung:

In zuvor fixierten und permeabilisierten Zellen lassen sich spezifische Gentranskripte auf Einzelzellebene nachweisen. Derzeit wird die etablierte Multiplex RT-PCR zur Charakterisierung einzelner CTC Subpopulationen eingesetzt.