Chemisch-definierte und xenogen-freie Differenzierung humaner embryonaler Stammzellen in endodermale und pankreatische Vorläuferzellen

 

Fragestellung:

Die Differenzierung embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) in insulinproduzierende Zellen zur Zellersatztherapie des Diabetes benötigt in vitro die Nachahmung der in vivo Organogenese. Die derzeitigen Differenzierungsprotokolle sind nicht xenogen-frei oder chemisch-definiert, was eine klinische Anwendung ausschließt. Das Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines chemisch-definierten und xenogen-freien Protokolls zur Differenzierung in Zellen des definitiven Endoderm (DE) und in pankreatische Vorläuferzellen (PP-Zellen).

Methodik:

Humane ES-Zellen wurden in 2D- oder 3D(Suspensions)-Kultur mittels CHIR-99021 und ActivinA in DE-Zellen differenziert. Dabei wurden verschiedene Medienzusammensetzungen getestet um chemisch-definierte und xenogen-freie Bedingungen zu erhalten. Die weitere Differenzierung in PDX1-positive PP-Zellen erfolgte durch ein vorher etabliertes, adaptiertes Protokoll. Die Analyse erfolgte mittels Durchflusszytometrie, RT-qPCR und Immunfluoreszenz.

Ergebnisse:

Die Adaption des 2D-Protokolls zur DE-Induktion auf 3D-Suspensionsbedingungen resultierte in einer vergleichbaren Effizienz (ca. 80% DE-Zellen) mit ähnlicher Expression der DE-Markergene SOX17 und FOXA2 (> 100 – 10000-fach verglichen mit ES-Zellen). Unter chemisch-definierten 2D-Bedingungen zeigten sich eine höhere DE-Differenzierungseffizienz sowie eine bessere Proliferationsrate wenn RPMI anstelle von MCDB als chemisch-definiertes Basismedium verwendet wurde. Der Transfer zur 3D-Suspensionskultur ermöglichte xenogen-freie und chemisch-definierte Differenzierungsbedingungen, die eine effiziente DE-Induktion (ca. 80%), vergleichbar mit dem 3D-Standardprotokoll, ermöglichten. Die Ko-Expression der DE-Markergene SOX17 und FOXA2 wurde dabei zusätzlich auf der Proteinebene nachgewiesen. Die unter xenogen-freien und chemisch-definierten Bedingungen erhaltene DE-Zellen konnten durch weitere Differenzierung in PDX1-positive PP-Zellen spezifiziert werden, welches auf Genexpressions- und Proteinebene nachgewiesen wurde.

Schlussfolgerungen:

Das hier etablierte chemisch-definierte und xenogen-freie 3D-Differenzierungsprotokoll ist ein wichtiger Schritt in Richtung einer möglichen Zellersatztherapie des Diabetes. Die so erhaltenen DE-Zellen waren funktional und konnten in PDX1-positive PP-Zellen differenziert werden.