Identifizierung einer ubiquitin-ähnlichen Domäne als neuer potentieller Interaktionspartner der Glucokinase in Beta-Zellen des Pankreas

Fragestellung: In den Beta-Zellen des Pankreas ist die Glucokinase (GK) das Signalerkennungsenzym der glucoseinduzierten Insulinsekretion. Die Regulation der GK findet hauptsächlich auf posttranslationaler Ebene statt. Der endogene GK Aktivator, das bifunktionelle Enzym 6-Phosphofructo-2 Kinase/Fructose-2,6-Bisphosphatase wird in der Leber und in Beta-Zellen exprimiert. Dagegen ist das inhibitorische Glucokinase-Regulatorprotein nur in der Leber nachweisbar. Ziel dieser Studie war es, weitere Beta-Zell spezifische Interaktionspartner mithilfe eines Yeast Two-Hybrid Screenings (YTHS) einer Ratteninsellibrary zu identifizieren.

Methodik: RNA wurde aus Ratteninseln des Pankreas isoliert. Die cDNA Library wurde mittels SMART Technologie (Clontech) generiert, in den Vektor pGADT7-R kloniert und in S. cerevisiae AH109 exprimiert. Das YTHS wurde mittels Paarung mit S. cerevisiae Y187 durchgeführt, die den Vektor pGBKT7-GK exprimierten. Die aus drei unabhängigen Ansätzen resultierenden 5,5×10⁵ Klone wurden mittels Histidin und Adenin Reportergen-Assays charakterisiert. Die Interaktion mit der GK wurde in MIN6 Zellen mithilfe eines fluoreszenzbasierten Mammalian Two-Hybrid Systems (MMTHS) und Hochdurchsatzmikroskopie (scanR-System, Olympus) weiter untersucht.

Ergebnisse: Mithilfe des Histidin-Reportergen-Assays konnten 73 positive Klone selektiert werden, wobei nur vier zusätzlich eine signifikante Adenin-Reportergen Expression aufwiesen. Lediglich ein Klon zeigte eine spezifische Interaktion mit der GK im Vergleich zum Kontrollgen Lamin. Sequenz- und Protein-Datenbank Analysen zeigten, dass es sich um ein 180 Aminosäuren langes Proteinfragment handelt, welches eine Homologie zum N-terminalen Teil des Proteins Midnolin 2 aufweist. Innerhalb dieses Fragments konnte mithilfe einer NCBI-Blast Analyse eine vollständige ubiquitin-ähnlichen Domäne (UbD) mit 72 Aminosäuren identifiziert werden. Zur Analyse im MMTHS wurde die UbD mit der Bindungsdomäne (pBIND-ECFP-UbD) und die GK mit der Aktivierungsdomäne (pACT-GK) subkloniert. Die Interaktion zwischen pBIND-ECFP-UbD und pACT-GK wurde im Vergleich zur Kontrolle (pACT) in MIN6 Zellen untersucht. Ein Anstieg der EYFP Expression im Verhältnis zur konstitutiven ECFP Expression zeigte eine spezifische Interaktion zwischen der UbD und GK.

Schlussfolgerung: Es wurde eine UbD als potentieller neuer Interaktionspartner der GK im YTHS identifiziert und im MMTHS verifiziert. In MIN6 Beta-Zellen scheint die Interaktion zwischen GK und UbD bei niedriger Glucosekonzentration stärker ausgeprägt zu sein. Somit könnte diesem neuen Interaktionspartner eine wichtige Rolle in der glucoseinduzierten Insulinsekretion in den Beta-Zellen des Pankreas zukommen. Unsere Studie unterstützt die Hypothese der GK Regulation durch Ubiquitinierung oder direkte Modulation durch UbD-enthaltende Proteine.