Ein in vitro Testverfahren zur Charakterisierung von TBC1D1

Fragestellung: In Kreuzungsexperimenten wurde Tbc1d1 von uns als neues Suszeptibilitätsgen für Adipositas und Typ-2-Diabetes bei der Maus identifiziert (Chadt et. al, Nat. Genet. 40, 1354–1359 (2008)). TBC1D1 ist ein Paralog des Insulinsignalproteins AS160 und reguliert über eine intrinsische Rab-GAP (GTPase activating protein) Aktivität die insulinstimulierte Glucoseaufnahme im Skelettmuskel. Der genaue Mechanismus der Regulation von GAPs aus der TBC1D-Familie als auch die spezifischen Effektoren von TBC1D1 sind jedoch weitgehend unbekannt. Durch die Etablierung eines in vitro Testverfahrens zur Messung der enzymatischen Spezifität und Rab-GAP Aktivität von TBC1D1 soll das Protein funktionell charakterisiert werden. Ein Testverfahren ermöglicht zudem die Entwicklung neuer TBC1D1-spezifischer Wirkstoffe zur Behandlung von Adipositas und Typ-2-Diabetes.

Methodik: Für die Etablierung eines in vitro Testverfahrens wurden cDNAs für Rab-GTPasen und die 48 kDa GAP-Domäne aus TBC1D1 kloniert, in E. coli als GST-Fusionsproteine exprimiert und mittels GSH-Affinitätschromatografie aufgereinigt. Zur Herstellung von volllängen TBC1D1 (1255 AS; SP-Acc:Q60949) wurden Baculoviren generiert, die His6-TBC1D1 bzw. eine inaktive Punktmutante (His6-R941K) in Sf9-Insektenzellen exprimieren. His6-TBC1D1 wurde über Ni-NTA-Affinitätschromatografie aufgereinigt. Die GTPase-Aktivität der Rab-Proteine wurde durch Umsatzmessungen von radioaktiv markiertem GTP bestimmt.

Ergebnisse: Die löslichen Formen der GST-Rabs und GST-GAP Domäne wurden mit Ausbeuten von ca. 0,1mg/l Kultur aus Bakterienlysaten aufgereinigt. Die rekombinante TBC1D1-GAP-Domäne zeigte die höchste spezifische Aktivität für die im Muskel stark exprimierte Isoform Rab10. In Anwesenheit der GAP-Domäne wurde die GTPase-Aktivität von Rab10 um das >10fache stimuliert. Das His6-markierte 160 kDa TBC1D1-Protein wurde über das Baculovirussystem in Sf9-Zellen exprimiert und mit hoher Ausbeute (0,3mg/l Kultur) gereinigt. Erste Versuche belegten eine katalytische GAP-Aktivität von His6-TBC1D1 gegenüber GST-Rab10 in vitro. Um die Stabilität von His6-TBC1D1 zu erhöhen und die Robustheit des Testverfahrens zu verbessern, müssen die Reinigungs- und Reaktionsbedingungen jedoch noch weiter optimiert werden.

Schlussfolgerung: Eine loss-of-function-Mutation in TBC1D1 schützt Mäuse vor Adipositas und Diabetes, während eine seltene Mutation im TBC1D1-Gen beim Menschen (R125W) zu extremer Adipositas führen kann. TBC1D1 stellt daher eine neue pharmakologische Zielstruktur für die Behandlung der Erkrankung dar. Das von uns entwickelte Testverfahren kann die Suche nach TBC1D1-Inhibitoren ermöglichen. Unsere ersten Ergebnisse identifizieren Rab10 als möglichen primären Effektor in der Insulinsignalkaskade des Skelettmuskels.

Unterstützt durch DFG (GRK1208) und DDG (Menarini-Förderung).