Ligand-induced biphasic thermal denaturation of RNAase A

Abstract

DSC measurements have been accomplished in aqueous solutions of bovine pancreatic ribonuclease A (RNAase A) in the presence of subsaturating amounts of 3′ cytidine monophosphate (3′ CMP) and 2′ cytidine monophosphate (2′ CMP) atpH 5.0 and 5.5. In these conditions the experimental profiles do not conform to a one-step unfolding process. It can be emphasized, as a general phenomenon, that a strong linkage between the temperature-induced protein unfolding and the ligand binding, when the ligand is less than the saturation level, causes marked distortions from a two-state transition. A purely equilibrium thermodynamic analysis gives a correct account of this behaviour and allows to simulate calorimetric curves. It is thus possible to obtain, in an indirect manner, information about the thermodynamic parameters concerning the binding process, namely the association constant and the binding enthalpy. The values ofKb and Δ_b H for 3′CMP and 2′CMP, so determined, are consistent with the literature data.

Zusammenfassung

BeipH 5.0 und 5.5 wurden in Gegenwart von untersättigenden Mengen von 3′Cytidinmonophosphat (3′CMP) und 2′Cytidinmonophosphat (2CMP) DSC-Messungen an einer wäßrigen Lösung von Rinderbauchspeicheldrüsen-Ribonuklease A (RNAase A) durchgeführt. Unter diesen Bedingungen stimmt der experimentelle Verlauf nicht mit einem einstufigen Entfaltungsprozeß überein. Man kann als eine generelle Erscheinung hervorheben, daß—wenn die Liganden unter dem Sättigungspegel liegen—eine enge Verbindung zwischen der temperaturinduzierten Entfaltung des Proteins und der Ligandenbindung bezeichnende Störungen aus einem Zwei-Zustands-Übergang verursachen. Eine reine thermodynamische Gleichgewichts-analyse ergibt eine korrekte Darstellung dieses Verhaltens und erlaubt die Simulation kalorimetrischer Kurven. Somit ist es möglich, auf indirekte Weise Informationen über die thermodynamischen Parameter (Assoziationskonstante, Bindungsenthalpie) des Bindungsprozesses zu erhalten. Die auf diese Weise ermittelten Werte fürK _b und Δ_b H von 3′CMP und 2′CMP stimmen mit den Literaturangaben überein.